于 慧， 杨晓敏， 屈双丽， 秦 磊， 冯 月， 王占黎， 孙 刚△

(包头医学院第二附属医院 1高血压研究所, 2检验科， 内蒙古 包头 014030； 3天津市宁河区医院心内科, 天津 301504； 4包头医学院研究生学院， 内蒙古 包头 014040)

心血管疾病严重危害人类健康。心肌肥大是许多心血管疾病终末期共同的病理生理表现，也是导致慢性心力衰竭的主要原因之一[1]。研究显示，心肌细胞凋亡在心力衰竭的发生、发展过程中扮演着关键作用，可能是引起心力衰竭的主要原因之一[2]；体内实验表明，抑制心肌细胞凋亡可以改善心脏收缩功能[3]。与正常心肌细胞相比，肥大心肌细胞凋亡率显著增高，且对凋亡刺激因子的敏感性增加。心脏肥大细胞通过脱颗粒作用，释放多种炎症介质，直接参与心肌凋亡的过程[4]。以往研究显示，p38 MAPK在肥大心肌细胞凋亡的信号转导途径中起关键作用[5-7]。Budak等[5]证实，抑制p38 MAPK能显著上调Bcl-2蛋白的表达，进而抑制肥大心肌细胞凋亡。

微小RNA(microRNAs, miRNAs, miR)是一类长度约19～24个核苷酸分子组成的内源性非编码小分子RNA, 通过特异性结合靶基因mRNA的3′-端非翻译区，抑制靶基因mRNA 的翻译或促进其降解，从而发挥基因调控作用[8]。miR-139-3p是miR-139家族的主要成员之一，该家族在肿瘤细胞增殖和侵袭的调控中起关键作用[9-10]。研究证实，miR-139-3p在多种肿瘤中差异表达，并参与了细胞凋亡的病理生理过程[11]。本课题组首次检测到，在两肾一夹高血压大鼠心肌组织中miR-139-3p表达上调[12]。但是，miR-139-3p在肥大心肌细胞中的表达情况及其是否与心肌细胞凋亡相关，目前尚不完全清楚。本研究通过建立低氧诱导原代心肌细胞凋亡模型，观察miR-139-3p的表达情况，并探讨其与心肌细胞凋亡的关系。

材 料 和 方 法

1 实验动物及主要仪器试剂

高糖DMEM培养液、胎牛血清、II型胶原酶和5-溴-2′-脱氧尿苷(5-bromo-2′-deoxyuridine,BrdU)购自Gibco；缺氧盒购自日本三菱公司;MirVana miRNA提取试剂盒、TaqMan MicroRNA Reverse Transcription逆转录试剂盒、TaqMan Universal PCR Master Mix II扩增试剂盒、miR-139-3p引物 (002546)和U6 snRNA引物(001973)购自Applied Biosystems;Wistar乳大鼠(出生1～3 d)购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK(京)2012-0001]；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自BD;兔抗大鼠cleaved caspase-3 Ⅰ抗购自Cell Signaling Technology;兔抗大鼠GAPDH Ⅰ抗购于杭州贤至生物科技有限公司;山羊抗兔Ⅱ抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司;miR-139-3p抑制剂(micrOFFTMrno-miR-139-3p inhibitor)和miR-139-3p抑制剂阴性对照(micrOFFTMinhibitor negative control)由广州锐博生物科技有限公司合成。XRS+化学发光凝胶成像仪购自BIO-RAD;ABI7500实时荧光定量PCR仪购自Applied Biosystems。

2 方法

2.1细胞凋亡模型制备及实验分组 参照Drawnel等[13]的方法，取1～3 日龄Wistar乳大鼠，无菌操作取出心脏以无血清DMEM高糖培养液洗3次，并剪成1 mm×1 mm×1 mm组织块。使用0.6 g/L II型胶原酶5 mL消化10 min，37 ℃水浴中共消化7次，弃去首次消化液，以含20%胎牛血清的DMEM高糖培养液终止消化。收集细胞悬液，1 000×g离心10 min, 吸出上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，经200目细胞筛网过滤后，置于37 ℃、5% CO2培养箱中差速贴壁90 min。细胞上清液以约5×108/L细胞密度接种于6孔板中。加入0.1 mmol/L BrdU抑制成纤维细胞生长，24 h后换液。参照文献报道[14]，通过低氧诱导方法建立新生大鼠原代心肌细胞凋亡模型。心肌细胞培养48 h后，将细胞分为低氧(hypoxia)组和正常培养(normal control)组，每组设置3个平行孔。低氧组细胞置于37 ℃密闭的缺氧盒中(95% N2和 5% CO2)培养12 h，正常培养组细胞于37 ℃、5% CO2培养箱中培养12 h。

2.2心肌细胞凋亡的检测 各组细胞造模后(每组3个平行孔)，使用流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率，使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(BD Pharmingen)，按照试剂说明书进行操作。使用PBS洗涤2次，消化收集细胞后，加入100 μL binding buffer缓冲液重悬细胞，每个培养孔细胞均制成1×109/L的细胞悬液，再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混匀，室温避光孵育15 min，再加入400 μL binding buffer缓冲液混匀后，使用流式细胞仪 (Canto II, BD) 检测分析。此外各组细胞(每组3个平行孔)造模后，通过Western blot检测凋亡模型中cleaved caspase-3的表达，使用M-PER哺乳动物细胞总蛋白抽提试剂盒(Thermo)抽提每孔细胞总蛋白，SDS-PAGE后，PVDF膜湿转(100 V，90 min)，5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入兔抗大鼠cleaved caspase-3抗体(1∶1 000)和兔抗大鼠GAPDH抗体(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10 min；加入山羊抗兔Ⅰ抗(1∶4 000)室温孵育2 h后，TBST洗膜3次，每次10 min。ECL化学发光显色，使用化学发光凝胶成像仪检测目的条带，采用Bio-Rad Image LabTM软件分析结果，以目的蛋白与GAPDH内参照的比值表示蛋白相对表达量。

2.3RT-qPCR检测miR-139-3p的表达 各组细胞造模后(每组3个平行孔)，使用PBS洗涤2次，采用MirVana miRNA提取试剂盒提取每个培养孔细胞总miRNAs，按产品说明书步骤操作。使用TU1900紫外分光光度计检测miRNAs的纯度和浓度，紫外分光光度计检测抽提得到的miRNAs的A260/A280为1.9，使用相对定量比较Ct法对miR-139-3p的表达水平进行定量分析。采用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription逆转录试剂盒将miRNAs逆转录为cDNA，按产品说明书步骤操作，采用15 μL反应体系：dNTP mix 0.15 μL；MultiscribeTMRT enzyme 1.0 μL；10×RT buffer 1.5 μL；RNase Inhibitor 0.19 μL；Nuclease free water 4.16 μL；RT primer 3 μL；miRNA样品5 μL (10 ng)。反应条件：16 ℃ 30 min； 42 ℃ 30 min； 85 ℃ 5 min。逆转录产物的实时荧光定量扩增采用TaqMan Universal PCR Master Mix II 试剂盒，以U6 snRNA为内参照(Applied Biosystems)。扩增效率一致性实验采用5个倍比稀释的逆转录产物cDNA(最高浓度的cDNA样本为1 ng microRNA逆转录产物)，以cDNA浓度稀释度作为横坐标，ΔCt(miR-139-3p Ct值-内参照U6 snRNA Ct值)为纵坐标，绘制关系曲线，数据采用线性回归分析，结果显示，直线斜率的绝对值为0.009，接近于0，说明目的基因与内参照基因的扩增效率一致性好，见图1。实时荧光定量扩增采用20 μL反应体系：2×TaqMan Universal Master Mix II 10 μL；miR-139-3p 或U6 snRNA探针引物20×TaqMan Assay 1.0 μL；cDNA模板与dH2O共9 μL(cDNA模板约为100 ng)。反应条件按产品说明书步骤操作，每个反应设3个复孔。相对定量反应结果采用2-ΔΔCt方法分析[15]。

Figure 1.A plot of cDNA dilution ratio versus ΔCt in RT-qPCR.

图1RT-qPCR中cDNA稀释度与ΔCt的关系曲线

2.4miR-139-3p抑制剂转染 心肌细胞培养48 h后，将细胞分为miR-139-3p抑制剂组(miR-139-3p inhibitor)和miR-139-3p抑制剂阴性对照组(negative control)，每组设置3个平行孔。miR-139-3p抑制剂组，应用Lipofectamine 3000 (Opti-MEM配制)转染miR-139-3p抑制剂，置于37 ℃密闭的缺氧盒中(95% N2和 5% CO2)继续培养12 h； miR-139-3p抑制剂阴性对照组转染miR-139-3p抑制剂阴性对照，置于37 ℃密闭的缺氧盒中(95% N2和 5% CO2)继续培养12 h。各组细胞给药造模后，采用流式细胞术和Western blot实验检测细胞凋亡情况(具体实验操作方法同上)。

3 统计学方法

使用统计软件SPSS 17.0进行统计学处理。计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示，两组间比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 原代心肌细胞的形态观察

心肌细胞培养24 h后，呈贴壁生长，可见少数细胞开始搏动，但搏动微弱，且节律不规则。48 h后观察到心肌细胞呈梭形或多边形，有伪足伸出，细胞之间可以相互接触交织成网，多数心肌细胞出现自发性节律性搏动，见图2。

Figure 2.Micrograph of cultured rat neonatal cardiomyocytes after 48 h.

图2培养48h后的原代心肌细胞形态

2 流式细胞术检测心肌细胞凋亡情况

低氧诱导12 h后，流式细胞术结果显示，与正常培养组比较，低氧组心肌细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，见图3。

3 Western blot检测凋亡模型中cleaved caspase-3表达

低氧诱导12 h后，采用Western blot检测凋亡模型中cleaved caspase-3的表达。结果显示，与正常培养组相比，低氧组细胞中凋亡蛋白cleaved caspase-3表达显著升高(P<0.05)，见图4。

4 低氧培养对miR-139-3p表达的影响

以RT-qPCR方法检测miR-139-3p的表达情况。结果显示，低氧培养12 h后，与正常培养组比较，低氧组心肌细胞中miR-139-3p的表达水平显著上升(P<0.05)，见图5。

Figure 3.The apoptosis rate of cardiomyocytes detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal control group.

图3流式细胞术检测心肌细胞凋亡率

Figure 4.The expression of cleaved caspase-3 detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal control group.

图4Westernblot检测cleavedcaspase-3的表达情况

Figure 5.The relative expression of miR-139-3p detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal control group.

图5RT-qPCR检测miR-139-3p的表达情况

5 miR-139-3p抑制剂转染后原代心肌细胞凋亡水平的变化

低氧诱导12 h后，流式细胞结果显示，与miR-139-3p抑制剂阴性对照组相比， miR-139-3p抑制剂组心肌细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，见图6。

Figure 6.miR-139-3p inhibitor decreased the apoptosis rate of cardiomyocytes. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnegative control group.

图6miR-139-3p抑制剂转染后心肌细胞凋亡率的变化

Western blot结果显示，miR-139-3p抑制剂组凋亡蛋白cleaved caspase-3表达也显著降低(P<0.05)，见图7。

Figure 7.miR-139-3p inhibitor decreased the expression of cleaved caspase-3. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnegative control group.

图7miR-139-3p抑制剂转染后cleavedcaspase-3的表达情况

讨 论

miR-139位于11号染色体PDE2A基因的第2外显子上，在乳腺癌、胃癌、肝细胞癌和结肠癌等多种肿瘤细胞中异常表达[16-19]，进而参与调控肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移[20-21]。课题组前期研究观察到，miR-139-3p在两肾一夹高血压大鼠心肌组织中表达显著上调，推测其可能参与了高血压大鼠心肌肥厚的病理过程。信号通路分析软件IPA(经典通路数据库)分析显示，MAPK1是miR-139-3p的靶基因之一[12]，Budak等[5]进一步通过实验证实了这一结论。已知MAPK1与心肌细胞凋亡关系密切，因此，推测miR-139-3p可能与心肌细胞凋亡相关。针对miR-139-3p表达调控机制，过去的研究大多围绕着肿瘤等疾病。Huang等[22]的研究显示，miR-139-3p能通过下调NOB1基因表达来显著诱导宫颈癌细胞凋亡。但miR-139-3p与心肌细胞凋亡的关系，尚不清楚。

为了证实这一推测，本实验构建了原代心肌细胞的凋亡模型。目前，低氧诱导的心肌细胞凋亡模型已被广泛应用。Tanaka 等[23]在体外培养的新生大鼠心肌细胞中观察，在不更换细胞培养液的情况下低氧诱导12 h即可出现心肌细胞凋亡，并且随着低氧时间的延长逐渐加重。本实验结果也证实，低氧诱导心肌细胞凋亡，且促进cleaved caspase-3蛋白的表达。Cleaved caspase-3蛋白为caspase-3蛋白相对分子量约为17 kD的活性亚单位，一般认为，当细胞被凋亡信号激活时，无活性的caspase-3酶原被裂解为有活性的cleaved caspase-3，标志着凋亡过程进入到不可逆转阶段[24]。上述结果表明，通过低氧诱导的方法成功地建立了原代心肌细胞凋亡模型。

本实验采用RT-qPCR方法检测miR-139-3p的表达水平，观察到低氧组心肌细胞中miR-139-3p表达上调，抑制miR-139-3p表达能降低低氧诱导的心肌细胞凋亡及cleaved caspase-3的表达，提示miR-139-3p可能与心肌细胞凋亡有关。近期Diaz等[25]的研究显示，在Wistar 大鼠心肌缺血再灌注损伤模型中，miR-139-3p的表达水平显著增高，尿皮质素多肽(Urocortin)能通过下调miR-139-3p的表达水平发挥其对缺血再灌注心肌的保护作用，推测miR-139-3p的异常表达可能通过下调FoxO1等因子的表达参与了心肌缺血再灌注损伤中细胞凋亡过程。本研究中，miR-139-3p在低氧诱导心肌细胞凋亡模型中表达水平显著升高，miR-139-3p的表达被抑制后，心肌细胞的凋亡率也明显下降，这一结果也在一定程度上证实了Diaz等[25]的研究推测。本研究着重探讨了miR-139-3p与心肌细胞凋亡的关系及可能机制，所获结果有助于阐明心肌细胞凋亡的分子机制。但低氧诱导是否会引起心肌细胞的细胞周期变化和凋亡相关基因bcl-2、bax和FoxO1的表达，以及miR-139-3p如何通过调控靶基因影响心肌细胞凋亡等，这些问题还有待今后进一步深入研究。