张琳婧，梁羽茜，张秋艳，赵丕文，王媛媛，胡秀华*

(1.北京中医药大学生命科学学院，北京 100029；2.北京中医药大学中医学院，北京 100029)

帕金森病(Parkinson's disease,PD)又称震颤麻痹，是第二大神经系统疾病，仅次于痴呆，发病人群集中于中老年段。 当前，我国老龄化社会的日益发展，人均期望寿命逐步增加，患病率预计会随之逐渐升高,这不仅严重影响个人生存质量及其社会功能，更会增加家庭、社会和经济的负担[1-2]。流行病调查发现，老年人群中帕金森病患病率成倍增长，其中，65 岁以上老年人群患病率为1%～2%、85岁以上为3%～5%[3]，患病率60岁为0.25%、65岁为0.5%、70岁为1%、75岁为1.5%、80岁为2.5%、85岁为3.5%～4.0%[4]。

帕金森病属于中医“颤证”范畴，历代医家认为帕金森病中医病因病机复杂，但基本病机为本虚标实，本虚多为肝脾肾及气血阴阳亏虚，标实为风、火、痰、瘀、热。病程初期，风、火、痰、瘀、热互结，病久易导致虚实夹杂之证，病程后期则累及肝肾，导致肝肾不足，精血亏虚[5]。帕金森病分为不同证型，包括肝肾阴虚型、痰热动风型、气血两虚型及瘀血阻络型。中医治则以息风止颤为主，同时针对不同证型，辅以培补肝肾、清热化痰、益气养血及活血通络[6]。亚洲使用中药治疗神经系统疾病有先例, 范围涉及帕金森病、癫痫、中风等[7-9]。中药方剂牵正散由白附子、白僵蚕、全蝎组成, 具有祛风化痰, 通络止痉的作用。白附子祛风化痰、散寒止痛为君药，全蝎息风镇痉、通络止痛，白僵蚕息风止痉、祛风止痛。全蝎与白僵蚕共为臣药。现代研究表明，牵正散提取物可能通过减轻线粒体损伤、保护神经元从而显著抑制帕金森病模型小鼠震颤，改善其运动障碍[10]。本文以中医息风止痉为出发点，利用PSI诱导PC12细胞，建立PC12细胞帕金森病模型，并在体外研究牵正散水煎剂对PSI诱导形成的PC12细胞帕金森病模型的增殖情况的影响。

1 材料与仪器

1.1 材料

蛋白酶体抑制剂I(Proteasome inhibitor I,PSI)，胎牛血清(Gibco美国)，马血清(Invitrogen)，1640培养基(Gibco),生理盐水，0.05%胰蛋白酶( Hy-clone公司),3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐噻唑蓝(MTT，Sigma公司)，二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司)，牵正散购自北京中医药大学国医堂门诊部，大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(pheochromocy-toma cells，PC12细胞)购自北京协和医学院基础学院细胞中心。

1.2 仪器

倒置显微镜(Olympus日本)，细胞培养瓶(Corning公司)，CO2培养箱(BINDER德国)，酶标仪(Bio-Tek，美国)，24孔板细胞培养板(Corning公司),96孔细胞培养板(Corning公司)。

1.3 药物制备

4 gPSI粉末溶解于4 mLDMSO中；白附子、白僵蚕、全蝎各9 g，按常规中药煎煮方法煎煮至100 mL时，将牵正散水煎剂移入容量为150 mL的烧杯中，并用高压灭菌过的培养皿盖住烧杯口煎煮至10 mL，将烧杯转移至超净工作台，离心1 000 r/min、20 min，取上清液即为牵正散水煎剂，4℃密闭保存。取1 mL牵正散水煎剂与2 mL1640培养基混合加入细胞培养瓶中，置于37℃，5%CO2的培养箱内静置培养24 h后，于倒置显微镜下观察培养基，确定无菌后，将牵正散水煎剂4℃保存，浓度为2 g/mL的储存液。

2 实验方法

2.1 MTT法测定牵正散水煎剂对PC12细胞的细胞毒性作用

对数生长期的PC12细胞计数每孔2×104个/mL溶于1640培养基中，以每孔体积100 μL培养基接种于96孔细胞培养板中，置于37℃、5%CO2培养箱内培养24 h后，于每孔加入不同浓度(终浓度分别为1.5,3,6,12,24 mg/mL)牵正散水煎剂的1640培养基，同时设空白对照组，每组设6个重复孔。继续培养48 h后，吸出孔中全部液体后，用PBS清洗96孔板1次。避光条件下，1 mL浓度为5 mg/mL MTT溶液与9 mL无血清1640培养基混匀后加入96孔板,每孔加10 μL。用锡纸严密包裹整个96孔板，在培养箱静置培养4 h，弃上清并每孔加入150 μLDMSO，于摇床震荡40 min，置于酶标仪570 nm处测量光吸收值(OD值)。按抑制率(%)=(1-实验组OD均值/对照组OD均值)×100%计算PC12细胞生长抑制率, 重复测定牵正散水煎剂对PC12细胞增殖的影响，根据结果计算出牵正散水煎剂的IC0、IC25、IC50剂量。

2.2 计算牵正散水煎剂的IC0、IC25及IC50剂量

实验重复3次，对牵正散水煎剂浓度和PC12的抑制率进行线性拟合，进行统计学分析，根据结果计算出PC12细胞生长抑制率为0%时对应的牵正散水煎剂浓度(IC0)、PC12细胞生长抑制率为25%时对应的牵正散水煎剂浓度(IC25)及PC12细胞生长抑制率为50%时对应的牵正散水煎剂浓度(IC50)。

2.3 利用DAPI染色荧光观察结合伊红染色观察PSI诱导PC12形成的帕金森病模型

将对数生长期的PC12细胞以2×104个/mL接种在24孔培养板中，分别用0.1%DMSO和PSI(浓度分别为1,2,4,6,8 μmol/L)处理PC12细胞48 h后，进行HE染色，4%多聚甲醛固定15 min，伊红染色15 min，双蒸水冲洗1次，DAPI染色15 min后，放置于荧光显微镜下观察并照相。

2.4 苏木精-伊红(HE)染色观察PSI诱导PC12形成的帕金森病模型

将对数生长期的PC12细胞以2×104个/mL接种24孔培养板，分别用0.1%DMSO和6 μmol/L PSI处理PC12细胞48 h后，4%多聚甲醛固定15 min，双蒸水冲洗1次，苏木精染液染色15 min，双蒸水冲洗1次，伊红染液染色15 min，双蒸水冲洗后于倒置显微镜镜下观察。此间在加PSI后24 h,48 h时于倒置显微镜下观察并照相。

2.5 不同浓度牵正散水煎剂对PSI诱导PC12细胞帕金森病模型增殖的影响

对数生长期的PC12细胞计数每孔2×104个/mL溶于1640培养基中，以每孔体积100 μL培养基接种于96孔细胞培养板中，置于37℃、5%CO2培养箱内培养24 h后，PSI模型组加入浓度为6 μmol/L的PSI诱导细胞形成帕金森病模型；牵正散水煎剂组分别加入IC0(3.038 6 mg/mL)，IC25(8.403 4 mg/mL)和IC50(13.768 2 mg/mL)；PSI加牵正散水煎剂组先后加入IC0(3.038 6 mg/mL)，IC25(8.403 4 mg/mL)和IC50(13.768 2 mg/mL)和浓度为6 μmol/L的PSI；同时设空白对照组，每个组设6个重复孔。培养箱继续培养48 h后，吸出孔中全部液体后，用PBS清洗1次96孔板。避光条件下，1 mL浓度为5 mg/mL MTT溶液与9 mL无血清1640培养基混匀后加入96孔板,每孔加10 μL。用锡纸严密包裹整个96孔板，在培养箱静置培养4 h，弃上清并每孔加入150 μLDMSO，于摇床震荡40 min，置于酶标仪570 nm处测量光吸收值(OD值)。按抑制率(%)=(1-实验组OD均值/对照组OD均值)×100%计算PC12细胞生长抑制率,测定牵正散水煎剂对PSI诱导PC12细胞帕金森病模型增殖的影响，重复3次，并根据结果计算出抑制率。

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 不同浓度牵正散水煎剂对PC12细胞的细胞毒性

用不同浓度的牵正散水煎剂(终浓度分别为1.5,3,6,12,24 mg/mL)分别处理细胞，同时设立空白对照组，48 h后，MTT实验结果显示，与空白对照组相比，1.5 mg/mL和3 mg/mL牵正散水煎剂处理PC12细胞时，可促进PC12细胞增殖，分别促进增殖达到3%和8%；浓度为6 mg/mL、12 mg/mL和24 mg/mL牵正散水煎剂处理PC12细胞时，呈不同程度的抑制作用，抑制率分别为5%，61%，91%，在24 mg/mL时抑制率达到最高91%，12 mg/mL组和24 mg/mL组与空白对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)，结果见表1。

表1 MTT测定牵正散对PC12细胞的细胞毒性影响

注：与空白对照组比较，*P<0.05

3.2 计算牵正散水煎剂对PC12细胞的IC0、IC25及IC50剂量

实验重复3次，对牵正散水煎剂浓度和PC12的抑制率进行线性拟合，进行统计学分析，根据结果计算出细胞生长抑制率为0%时对应的药物浓度(IC0)、细胞生长抑制率为25%时对应的药物浓度(IC25)及细胞生长抑制率为50%时对应的药物浓度(IC50)，结果见表2。

表2 牵正散水煎剂对PC12细胞的IC0、IC25、IC50剂量浓度

3.3 PSI诱导PC12细胞形成体外帕金森病模型

不同浓度PSI处理PC12细胞48 h后，DAPI和伊红共同染色后，观察结果如图1所示，正常对照组，部分细胞呈悬浮状态，散在或聚团生长，细胞大小及形态均匀一致，呈圆形，细胞膜完整，细胞核为椭圆形，核膜完整，边界清楚，结构正常，未见细胞核附近有其他染色物质出现；PSI模型组与空白对照组相比，随PSI浓度增大，同一视野下，细胞数量减少，细胞核边界模糊，形态改变，核膜不完整，细胞核附近出现红色嗜伊红物质。在PSI浓度1 μmol/L和2 μmol/L时，细胞数量有少量减少，细胞体积增大，细胞形态有轻微改变，但与正常对照组没有明显区别；在PSI浓度4 μmol/L时，细胞形态学改变明显，胞浆内开始出现嗜酸性表达；PSI浓度6 μmol/L时，细胞形态改变异常，由圆形变成纤维状，体积增大，并在细胞浆内明显可见被伊红染色的嗜酸性包含体，类似帕金森病的标志性病理改变Lewy小体，如图1中箭头所示；PSI浓度8 μmol/L时，细胞数量减少，悬浮细胞及细胞周围碎片增多，且形态改变及嗜酸性小体表达不太明显，结果见图1。

注：A-C：嗜酸性小体图1 DAPI结合伊红染色观察不同浓度PSI处理PC12细胞后嗜酸性小体形成的情况(×400)

3.4 苏木精-伊红(HE)染色观察PSI诱导PC12形成的帕金森病模型

用浓度为6 μmol/L的PSI分别处理PC12细胞24 h和48 h后，倒置显微镜下观察，结果显示如图2所示，细胞培养24 h及48 h后，空白对照组均无明显形态学及数量改变，细胞膜完整，胞浆内无杂质； PSI模型组在24 h后即出现堆叠与聚集趋势，细胞体积增大，少数细胞的细胞膜不完整，胞浆内开始出现杂质，48 h后细胞堆叠与聚集趋势愈发明显，较空白对照组细胞体积大，细胞膜不完整，形态破碎，胞浆内有大量杂质，细胞周围有凋亡碎片形成，且具有时间依赖性。

进一步HE染色验证，PSI作用PC12细胞48 h后进行HE染色，结果如图3所示，空白对照组PC12细胞胞核嗜碱性染色，胞浆嗜酸性染色，细胞膜完整，细胞核呈圆形及类圆形，细胞浆内无杂质出现；PSI模型组细胞，细胞体、细胞核体积明显增大，胞浆内空泡增多同时出现嗜酸性类Lewy小体，此小体嗜伊红、边界清楚。进一步证明PSI为6 μmol/L时，所得的体外帕金森病模型最为典型。

注:A:空白对照组24 h;B:空白对照组48 h;C:PSI6 μmol/L 24 h;D:PSI6 μmol/L 48 h图2 倒置显微镜下观察PSI 6 μmol/L诱导PC12细胞变成帕金森病模型的形态改变(×400)

注：A-D：胞浆内出现的嗜酸性包含体图3 HE染色PSI处理PC12细胞48 h后嗜酸性小体形成的情况(×400)

3.5 不同浓度牵正散水煎剂对PSI诱导PC12细胞帕金森病模型增殖的影响

不同浓度的牵正散水煎剂(浓度分别为3.038 6 mg/mL、8.403 4 mg/mL、13.768 2 mg/mL)分别作用在含有6 μmol/L PSI的PC12细胞中，48 h后，进行MTT检测，实验重复3次，对不同浓度牵正散水煎剂对PSI诱导PC12细胞帕金森病模型增殖结果进行统计学分析。实验结果如表3所示，与空白对照组相比，均有统计学意义，其中PSI模型组抑制率高达38.23%，牵正散水煎剂组在浓度为3.038 6 mg/mL、8.403 4 mg/mL、13.768 2 mg/mL时，抑制率分别为12.04%、17.32%和42.43%。PSI+牵正散水煎剂组在浓度时分别为3.038 6 mg/mL、8.403 4 mg/mL、13.768 2 mg/mL时，抑制率分别为24.53%、27.13%和41.76%。与PSI模型组比，PSI+牵正散水煎剂组中除浓度为13.768 2 mg/mL的牵正散水煎剂外，其他浓度的3.038 6 mg/mL和8.403 4 mg/mL的牵正散水煎剂，对PSI导致的PC12细胞增殖的抑制有不同程度的改善。其中PSI+3.038 6 mg/mL和PSI+8.403 4 mg/mL牵正散水煎剂组可以明显改变PSI所致的PC12细胞的增殖抑制，由抑制率38.23%，改变为24.53%和27.13%,差异具有统计学意义(P<0.05)，其中，3.038 6 mg/mL浓度的牵正散水煎剂对PSI模型组效果最好。说明牵正散水煎剂可以明显改善由PSI诱导的PC12帕金森病细胞模型的细胞增殖状况。

表3 MTT测定牵正散水煎剂对PSI对PC12细胞模型的影响

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与PSI模型组比较，#P<0.05

4 讨论

帕金森病的病机特点主要是本虚标实，在标实即风、火、痰、瘀、热互结的基础上，导致本虚肝肾亏虚。《素问·至真要大论》曰:“诸风掉眩，皆属于肝”。中医认为，肝主疏泄，主筋，属木。肝阴不足日久，则阴虚阳亢化风，出现头摇、肢颤；同时“阴虚而内风生”,导致阴液不能濡养筋脉出现肢体抽搐；另一方面气机升降失调，肝气郁结化火，肝阳扰动化热生风也可导致四肢颤震不已。由此可见“风气内动”是本病的病机核心，由风致颤。因此中医治则多以息风止痉为主，加以辨证论治[11]。而牵正散的功效是祛风化痰止痉，据现代药理研究证明：白附子、白僵蚕、全蝎均具有不同程度的抗癫痫、抗惊厥功能[12-14]。其中熊成成等[12]的研究表明，白附子具有抗惊厥、镇静、抗炎、镇痛作用。李晶峰等[13]的研究发现，白僵蚕具有抗凝、抗惊厥、抗血栓、抑菌、抗癌等药效。史磊等[14]发现全蝎中含有蝎毒、核苷类等生物活性成分,具有抗肿瘤、抗癫痫、抗哮喘、抗血栓、抗凝、镇痛等药理作用。因此本实验基于以上理论基础,研究牵正散水煎剂对PSI诱导PC12细胞的体外帕金森病模型影响。

近年来，外源性神经毒素诱导形成PD细胞模型的研究方法，在PD发病机制研究中发挥重要作用[15]。PC12细胞株具有神经细胞特性，且可稳定传代，其主要分泌物为儿茶酚胺类物质。目前，PC12细胞模型已成为抗PD药物的体外基础研究的理想细胞模型[16]。此模型利用MPTP建立，是探索PD发生机制、生化异常、线粒体异常及筛选神经保护药物的良好模型[17]，而用蛋白酶抑制剂(PSI)作用于PC12细胞建立的PD模型，实验中模拟的包涵体在形态和结构等方面，最接近PD患者的嗜酸性小体，成功再现了PD的重要特征[18]。本实验中DAPI染色结果显示，PSI浓度为4 μmol/L开始出现嗜酸性小体，PSI浓度为6 μmol/L最典型；从而将6 μmol/L应用于HE染色中，在HE染色结果中发现同样嗜酸性类Lewy小体，提示PSI诱导PC12细胞模拟帕金森病模型造模成功；使用PSI6 μmol/L造模成功后，我们将之前筛选的牵正散水煎剂的IC0、IC25、IC50应用于PC12细胞帕金森病模型，结果显示PSI+IC0(PSI+3.038 6 mg/mL)与PSI+IC25(PSI+8.403 4 mg/mL)组与空白对照组和PSI模型组比较，结果均具有统计学意义，说明合适浓度的牵正散水煎剂可降低PSI对PC12细胞的抑制率，即对PSI诱导的PC12帕金森病模型具有保护作用。PSI的诱导使PC12细胞结构及形态出现帕金森病的病理特征，首先提示，PSI适合做诱导剂用来造模，同时提示PC12细胞适合用来造模，最终指向PSI诱导的PC12体外帕金森病模型适合做体外抗PD模型。同时，MTT结果也揭示牵正散水煎剂对该体外细胞模型的保护作用，并且牵正散配伍符合中医辨证论治治则，同时有现在药理学研究佐证，为其科学性提供理论及现实支撑。

综上所述，本实验确定了PSI浓度6 μmol/L时诱导形成的PC12细胞模型具有帕金森病的特点，并可以应用到实验研究中。同时，不同浓度牵正散水煎剂对PC12细胞帕金森病模型具有不同的保护作用，其中3.038 6 mg/mL浓度的牵正散水煎剂对改善体外细胞帕金森病模型效果最好，本实验为牵正散的临床应用提供实验依据，为临床药物治疗帕金森病提供新的思路。