潘荣斌,朱大诚,陈宏伟,欧阳厚淦,赵志冬

(江西中医药大学 基础医学院,江西 南昌330004)

目前,在世界范围内,由车祸造成的创伤性脑损伤(Traumatic Brain Injury,TBI)是儿童和年轻人死亡或终身残疾的主要原因之一。而原发性脑损伤后,脑皮质神经元在一系列分子和神经化学方面的继发性变化才是影响临床病人死亡率的主要因素[1-2]。当前临床治疗TBI的有效化学药物十分有限[3]。中药复方补阳还五汤具有补气、活血、通络之功效,其补气类主药黄芪对脑神经元损伤的多个环节具有较为明显的干预作用。本研究选取补阳还五汤为模型药物,应用于TBI模型小鼠后,对小鼠运动行为和神经元凋亡的影响为综合评价指标,考察其在小鼠TBI模型中通过神经元保护作用降低继发性脑损伤危害的有效性,并初步探讨其作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

清洁级十月龄KM小鼠144只,体重21～26g(江西中医药大学实验动物中心提供,动物质量合格证号：JZDW№：2015-0160)

1.2 药物及配制

补阳还五汤依照清代王清任《医林改错》原方配制。称取黄芪120 g、当归尾6g、赤芍4.5 g、桃仁3g、红花3g、川芎3g、地龙3g,加入500m L双蒸水,用砂锅煎煮0.5h,倒出药液,然后加入250 m L的双蒸水煎煮15 min后倒出,取第一次煎煮的药液导入混合,药液再用旋转蒸发仪旋蒸浓缩至含生药2 g·m L-1,冷藏备用。

1.3 试剂

水合氯醛(武汉博莱特化工有限公司),多聚甲醛(江西东风药业股份有限公司),Bax兔抗、Bcl-2兔抗(美国Affinity公司),Caspase-3兔抗(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.4 主要仪器

电子脑皮质挫伤撞击仪(美国弗吉尼亚联邦大学),电子天平(DT10K),石蜡切片机(RM2135型)(德国Leica公司),显微照相仪(BX-41)(日本OLYMPUS),自动双重蒸馏器(上海亚荣生化仪器有限公司)。

2 方法

2.1 分组与给药

将实验小鼠随机分为模型组、假手术组和用药组。然后每组按给药时间分为1、3、7、14天四个亚组,除去手术或意外等原因死亡的小鼠后,每个亚组各留6只小鼠以备实验。用药组为补阳还五汤灌胃给药,给药剂量按照db=da×(Rb/Ra)×(Wa/Wb)1/3的公式换算(da、db是a、b两种动物每kg体重所需的剂量；Ra、Rb是两种动物的体型系数,小鼠和人的分别是59和100；Wa、Wb分别代表人和小鼠的体重)。除第一次灌胃在造模后4 h,其余每日固定时间灌胃1次。模型组和假手术组则给予同等体积的生理盐水。

2.2 实验动物造模

模型组及用药组造模：麻醉小鼠,将头部固定,手术区域消毒后用手术刀正中切开皮肤约1.5 cm,除去颅骨表面的骨膜,用微型磨钻在左侧离前囟前2mm,前囟后1mm,矢状缝旁3.5mm,钻3mm×3mm的颅窗,暴露硬脑膜。将小鼠移至eCCI操作台上,参照文献[4-5]建立中度TBI模型,将撞击参数设定为：速度6 m·s-1,停留时间：200 ms,深度2 mm。撞击后,向损伤部位滴注4万单位青霉素2～3滴预防感染,取小块骨蜡封闭缺损骨窗,细线缝合皮肤,对皮。各组动物均完成造模后,放回笼中,单独喂养。假手术组造模除手术暴露硬脑膜后,不破坏硬脑膜完整性、不进行打击之外,其余操作与模型组和给药组相同。

2.3 小鼠运动行为学评价：平衡木行走实验

将一条长0.8 m、宽2.5 cm的木条悬空放置于距地面10 cm高度,将小鼠放置于平衡木中间,用摄影机记录其2 min的活动情况,依据文献[6]菲尼计分标准计分：各组小鼠分别在第1、3、7、14天测量运动功能变化,重复操作3次取平均值。

2.4 尼氏染色观察小鼠皮质运动区病理形态学变化

对实验小鼠动物称重,麻醉,冲洗灌注,开颅取脑,4℃固定24 h。以脑损伤区为中心分别切取矢状面3 mm厚脑组织,梯度乙醇脱水,常规石蜡包埋,连续做5μm厚脑组织冠状切片。尼氏染色,进行神经元细胞的观察。

2.5 免疫组化染色及图片定量分析

对脑组织切片进行免疫组织化学染色(滴加的相对应一抗为Bax,1∶200；Bcl-2,1∶100；Caspase-3,1∶100,三种试剂均为兔抗多克隆抗体),后置于光镜下(10×40)采集TBI周边区图片；采用ImageProPlus6.0图像分析软件得到相应的AOD值,进行随机3个视野的AOD之和的平均数作为计数值。

2.6 统计学分析

3 结果

3.1 运动行为学评价结果—平衡木行走实验

模型组小鼠在TBI后1、3天表现较差,大都不能顺利穿过平衡木或直接跌落。7、14天组情况有所改善,部分能穿过平衡木,但跌倒概率大于50%。模型组与假手术组比较,差异具有显著统计学意义(P＜0.01)；而用药各组小鼠随着给药时间增加,运动表现改善愈加明显,其3、7、14天表现均优于模型组,7、14天组差异均具有显著统计学意义(P＜0.01)。见表1。

3.2 组织病理切片—尼氏染色观察结果(图1)

模型组小鼠TBI周边区神经细胞排列稀疏,变性较严重,胞浆内尼氏体减少,染色变浅,随着时间推移,正常形态细胞数量有下降趋势；与模型组比较,用药组相应区域正常形态神经元增多,尼氏体较丰富,染色深。

表1 行为学实验结果 (±s,n=6)

表1 行为学实验结果 (±s,n=6)

注:与假手术组比较,*表示P＜0.05,**表示P＜0.01；与模型组比较,◆表示P＜0.05,◆◆表示P＜0.01

组别 平衡木得分假手术组 0.60±0.04模型1天组 4.35±0.06**模型3天组 3.15±0.04**模型7天组 2.55±0.07**模型14天组 2.25±0.05**用药1天组 3.90±0.09**用药3天组 2.55±0.07*用药7天组 1.85±0.06**◆◆用药14天组 1.45±0.07*◆◆

图1 各组小鼠脑损伤周边区切片尼氏染色照片400X

3.3 免疫组化定量分析结果

3.3.1 Bax蛋白表达分析结果 模型各组之间相比较,TBI周边区Bax蛋白的表达,1、3天组均大于7、14天组；模型各组与假手术组相比较,TBI周边区Bax蛋白表达明显增强,各组统计结果差异有显著统计学意义(P＜0.01)；用药各组与模型组相比较,用药组1、3天与模型组同时相比较,Bax蛋白的表达略有下降,但差异没有统计学意义。用药组7、14天组与模型组7、14天相比较,其TBI周边区的Bax蛋白的表达显著减弱,AOD值统计结果差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。见表2、图2。

3.3.2 Bcl-2蛋白表达分析结果 模型组各时间段相比较,TBI周边区Bcl-2蛋白表达随时间的增加呈递减的趋势,1天组和14天组之间的差异据有统计学意义(P＜0.05),而1天组和3、7天组相比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。模型组3、7、14天组之间虽然呈递减的趋势,但是差异无统计学意义(P＞0.05)；模型组与假手术组相比较,模型组TBI周边区Bcl-2蛋白表达有显著区别,其差异有显著统计学意义(P＜0.01)；用药各组小鼠与模型组相比较,用药3、7、14天组TBI周边区的Bcl-2蛋白表达显著增强,统计结果具有显著统计学意义(P＜0.01)。见表2、图3。

表2 免疫组化各组小鼠脑损伤周边区Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白检测的结果 (±s,n=6)

表2 免疫组化各组小鼠脑损伤周边区Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白检测的结果 (±s,n=6)

注:与假手术组比较,*P＜0.05,**P＜0.01；与模型组比较,◆P＜0.05,◆◆P＜0.01。

组别 Bax Bcl-2 Bax/Bcl-2 Caspase-3假手术组 0.14±0.01 0.23±0.07 0.63 0.20±0.06模型1天组 0.68±0.02**0.44±0.04**1.54 0.44±0.05**模型3天组 0.72±0.07**0.41±0.03**1.76 0.52±0.06**模型7天组 0.56±0.05**0.38±0.08**1.47 0.41±0.08**模型14天组0.50±0.06**0.36±0.06**1.39 0.38±0.05**用药1天组 0.59±0.04**0.55±0.05◆**1.07 0.37±0.06**用药3天组 0.52±0.06**0.33±0.07◆◆**1.06 0.46±0.04*用药7天组 0.31±0.04◆**0.29±0.05◆**1.07 0.25±0.02◆◆**用药14天组0.27±0.05◆**0.28±0.05◆◆**0.96 0.23±0.01◆◆**

图2 各组小鼠脑损伤周边区切片Bax免疫组化染色照片400X

图3 各组小鼠脑损伤周边区切片Bcl-2免疫组化染色照片400X

3.3.3 Caspase-3蛋白表达分析结果 模型组与假手术组相比较,模型组TBI周边区Caspase-3蛋白表达明显增强,差异有显著统计学意义(P＜0.01),用药各组与模型组相比较,用药7、14天组TBI周边区的Caspase-3蛋白表达显著减弱,差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。补阳还五汤1天组、3天组与之相比较虽有减弱,但差异没有统计学意义。见表2、图4。

图4 各组小鼠脑损伤周边区切片Caspase-3免疫组化染色照片400X

4 讨论

目前,已有很多来自动物和人体的研究证据,TBI可诱导损伤周边区的神经元凋亡进而促进继发性脑损伤(secondarybraininjury,SBI)的发生[7],神经元的凋亡对TBI后神经细胞数量减少和功能减退具有重要影响。本实验对TBI后各组小鼠进行行为学评价,结果显示补阳还五汤在一定程度上促进TBI后运动功能恢复,这种改善随着用药时间成正相关,表明其对皮质运动区神经元有一定的保护作用。通过尼氏染色法检测TBI周边区的正常神经元数量,补阳还五汤组在用药早期与模型组无明显差别,但随用药时间延长,补阳还五汤组的正常形态神经元明显增多,变性凋亡细胞减少,表明补阳还五汤可在一定程度上抑制TBI后的细胞凋亡,减少神经元细胞的损伤。国内有研究显示,补阳还五汤可通过上调与细胞凋亡有关的Bcl-2蛋白的表达,降低Bax蛋白和Caspase-3蛋白表达以及Bax/Bcl-2的比值而发挥神经保护作用[8-9],本实验免疫组化结果显示,相比模型组,补阳还五汤组小鼠TBI周边区的Bcl-2蛋白表达明显增高,而Bax蛋白和Caspase-3蛋白表达及Bax/Bcl-2的比值则较为明显降低,表明补阳还五汤可能通过上述机制抑制TBI后的神经细胞凋亡,从而保护损伤区神经元,改善神经功能。

综上所述,本实验证实补阳还五汤有促进TBI后小鼠运动行为的改善,对TBI损伤周边区神经细胞有较为明显的保护作用,其可能机制之一为通过上调Bcl-2蛋白的表达,降低Bax蛋白和Caspase-3蛋白表达以及Bax/Bcl-2的比值,从而抑制损伤周边区的神经元凋亡。