丁婉雪，葛瑞瑞，黄金玲，周 鹏，王 靓，甘贤兵，施 慧，范晓芸

(1.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中医药大学中西医结合学院，安徽 合肥 230012；3.中药复方安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012；4.安徽中医药大学护理学院，安徽 合肥 230012)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)后心室重构与血流动力学、氧化应激、炎症反应等因素有关，其中氧化应激在AMI后心室重构发生发展过程中起着重要作用[1]。氧化应激损伤主要是心肌细胞缺血低氧条件下氧自由基大量生成，脂质过氧化产物增多，抗氧化酶不断消耗，抗氧化能力减弱，进而导致细胞凋亡，促进心室重构的发生[2-3]。苓桂术甘汤出自张仲景《伤寒论》，是温阳益气、健脾化饮的经典名方。课题组前期研究发现，该方能调节心力衰竭大鼠的神经内分泌细胞因子的分泌，改善血流动力学指标，阻抑心室重构，改善心功能[4-5]。本研究在前期基础上深入探讨苓桂术甘汤对H2O2导致心肌细胞氧化应激损伤及心肌细胞凋亡的影响。

1 材料

1.1 动物 雄性SD大鼠40只、体质量为(200±20)g，SD乳鼠20只(1日龄)，均购自安徽医科大学实验动物中心[实验动物生产许可证号：SCXK(皖)2017-001]。

1.2 药物 ①苓桂术甘汤：茯苓(批号 20170403)、桂枝(批号 20170312)、白术(批号 20170213)和甘草(批号 20170410)购自安徽普仁中药饮片有限公司。苓桂术甘汤按原方比例(茯苓、桂枝、甘草、白术质量比为4∶3∶3∶2)并参考文献[6]方法，由安徽省亳州市兴和药业有限公司制备成干燥粉末(每克干燥粉末含生药4.8 g)，分装密封，避光保存备用。②含药血清制备：将SD大鼠随机分为正常对照组和给药组。给药组用苓桂术甘汤8.4 g/kg(按照体表面积法计算相当于成人日常用量4倍)灌胃给药，每日2次，连续灌胃7 d，末次给药后45 min，经腹主动脉取血，静置1 h，3 000 r/min离心10 min，分离血清，56 ℃水浴30 min灭活补体，0.22 μm滤膜过滤除菌，-80 ℃保存备用。

1.3 试剂 H2O2(批号 20170901)：德州安捷高科有限公司；胶原酶Ⅱ(批号 EC0111)：美国Sigma公司；Hoechst 33258(批号 20160527)、甲基四唑蓝(MTT)(批号 1117X057)：北京索莱宝生物公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒(批号 P0012)、丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)试剂盒(批号 S0101)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒(批号 S0131)、谷胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)试剂盒(批号 C0016)和氧自由基试剂盒(批号 S0033)：碧云天生物试剂公司；兔抗大鼠抗体α-actin(批号 11163647S)：北京博奥森生物；山羊抗兔IgG二抗Cy3荧光标记(批号 ATQJA1701)：美国Abbkine公司；Annexin Ⅴ-FITC细胞凋亡检测试剂盒(批号 20171208)：上海贝博生物有限公司。

1.4 仪器设备 3111型恒温CO2培养箱：美国Thermo；Ⅸ81荧光倒置显微镜：日本Olympus；Accuri C6流式细胞仪：美国 Becton Dickinson；ATOM酶联免疫工作站：意大利MAROCHE。

2 方法

2.1 心肌细胞分离与培养 参考文献[7]采用差速贴壁法。取1日龄SD乳鼠，无菌取心脏，用PBS漂洗3次，加入胰蛋白酶，4 ℃过夜；加入等量完全培养基；再加入胶原酶Ⅱ消化液消化15 min；加入与消化液等量的完全培养基终止消化，1 000 r/min 离心5 min，弃上清，加入含BrdU(终浓度为1 mmol/L)的完全培养基制成细胞悬液，置于培养箱，90 min后收集未贴壁的心肌细胞，24 h后更换为含10% FBS的DMEM完全培养液，继续置于培养箱培养至72 h。

2.2 原代心肌细胞鉴定 取培养至72 h的原代心肌细胞，以3×105/mL的细胞密度种于6孔板。待细胞贴壁后。加入4%多聚甲醛固定30 min；Trinton室温孵育20 min，室温封闭1 h；弃上清液，加入一抗α-actin(1∶200)，4 ℃过夜孵育；加入Cy3二抗(1∶200)，避光孵育1 h；Hoechst染核10 min；倒置荧光显微镜下观察并拍照。

2.3 分组及模型复制 取分离培养72 h的心肌细胞，分为6组：正常对照组，空白血清(20%)组、H2O2模型组、苓桂术甘汤含药血清(5%、10%、20%)组培养12 h后，用H2O2100 μmol/L作用于心肌细胞6 h。

2.4 观察指标及检测方法

2.4.1 细胞活性检测 取分离培养72 h的心肌细胞，用完全培养液调密度至105/mL，接种于96孔板，每组设5个复孔，正常对照组及H2O2模型组加入完全培养液，空白血清组加入含20%正常大鼠血清的完全培养液，其余各组分别加入含有5%、10%和20%苓桂术甘汤含药血清的完全培养液，继续培养12 h。除正常对照组加入完全培养液外，其余各组均加入含H2O2(100 μmol/L)的完全培养液，继续培养6 h后，每孔加入MTT(0.5 mg/mL)20 μL，置于培养箱4 h。加DMSO 150 μL，缓摇10 min，在酶标仪490 nm波长下检测吸光度(absorbance，A)值，计算细胞活性。细胞活性=实验组A值/对照组A值×100%。

2.4.2 心肌细胞SOD、GSH-Px、LDH活性及MDA水平检测 取分离培养72 h的原代心肌细胞，以5×105/mL的密度接种于6孔板，分组同“2.3”项，用样品匀浆液分别提取细胞，取上清液，根据试剂盒操作，测定各组细胞中LDH、SOD、GSH-Px及MDA的A值，计算LDH、SOD和GSH-Px酶活性及MDA水平。

2.4.3 心肌细胞凋亡形态学观察 参考文献[8]用免疫荧光染色法观察心肌细胞凋亡形态。取分离培养72 h的原代心肌细胞，以3×105/mL的密度接种于6孔板，分组及处理同“2.4.1”项。经处理后，用4%多聚甲醛固定细胞30 min，每孔加入Hoechst 33258染色液，室温下避光染色5 min；倒置荧光显微镜下观察并拍照。

2.4.4 心肌细胞凋亡率检测 取分离培养72 h原代心肌细胞，按1×106/mL的密度接种于6孔板，分组及处理同“2.4.1”项。经处理后，按Annexin Ⅴ-FITC/PI检测试剂盒进行操作，流式细胞仪检测，检测结果用Flow Jo 7.6 软件分析。

2.4.5 心肌细胞氧自由基水平测定 取分离培养72 h原代心肌细胞，以5×105/mL接种于6孔板，分组及处理同“2.4.1”项。各组细胞经处理后，加入DCFH-DA(10 μmol/L)，继续培养30 min，收集细胞，流式细胞仪检测，检测结果用Flow Jo 7.6软件分析。

3 结果

3.1 原代心肌细胞观察与鉴定 分离培养24 h后心肌细胞开始贴壁生长，由散在圆形变为梭形。生长至72 h，可见细胞交互成网。Cy3标记的α-actin蛋白在心肌细胞胞浆中表达，染色呈红色(图1A)；细胞核染色后发出蓝色荧光(图1B)，两图合成，心肌细胞的阳性率大于90%(图1C)。

注:A.α-actin特异性蛋白表达;B.Hoechst 33258染色的细胞核;C.A图和B图的合成图

图1免疫荧光化学染色法鉴定心肌细胞(10×20倍)

3.2 对H2O2诱导的氧化损伤心肌细胞活力的影响 与正常对照组比较，H2O2模型组细胞活力明显降低(P<0.05)；与H2O2模型组比较，各苓桂术甘汤含药血清组心肌细胞活力均明显增强(P<0.05)；苓桂术甘汤含药血清组间细胞活力比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。表明苓桂术甘汤含药血清对H2O2诱导的心肌细胞损伤具有保护作用。见表1。

3.3 苓桂术甘汤含药血清对H2O2损伤的心肌细胞LDH、SOD、GSH-Px活性和MDA水平的影响 与正常对照组比较，H2O2模型组SOD及GSH-Px活性明显降低(P<0.05)，MDA水平及LDH活性显著增加(P<0.05)。与H2O2模型组比较，苓桂术甘汤含药血清组心肌细胞SOD及GSH-Px活性明显增加，LDH活性及MDA水平显著降低(P<0.05)。表明苓桂术甘汤含药血清能抑制心肌细胞MDA生成及LDH活性，提高SOD及GSH-Px活性，且具有浓度依赖性，对心肌细胞氧化应激损伤具有保护作用。见图2。

表1 苓桂术甘汤含药血清对H2O2损伤心肌细胞活力的影响

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与H2O2模型组比较，#P<0.05；与5%苓桂术甘汤含药血清组比较，△P<0.05；与10%苓桂术甘汤含药血清组比较，◇P<0.05

注：A.正常对照组；B. H2O2模型组；C. 20%空白大鼠血清组；D. 5%苓桂术甘汤含药血清组；E. 10%苓桂术甘汤含药血清组；F. 20%苓桂术甘汤含药血清组；与正常对照组比较，*P<0.05；与H2O2模型组比较，#P<0.05；与5%苓桂术甘汤含药血清组比较，△P<0.05；与10%苓桂术甘汤含药血清组比较，◇P<0.05

3.4 苓桂术甘汤含药血清对H2O2损伤心肌细胞凋亡的影响

3.4.1 苓桂术甘汤含药血清对凋亡心肌细胞形态的影响 荧光显微镜下正常对照组心肌细胞核质均匀、形状为椭圆形且呈较弱的蓝色荧光；与正常对照组比较，H2O2模型组心肌细胞的核浓染、荧光增强、颜色发白，呈现凋亡细胞特征；与H2O2模型组比较，苓桂术甘汤含药血清(10%、20%)组荧光强度减弱、核染色变浅。表明苓桂术甘汤含药血清能够抑制H2O2诱导的心肌细胞凋亡。见图3。

注：A.正常对照组；B. H2O2模型组；C. 20%空白大鼠血清组；D. 5%苓桂术甘汤含药血清组；E. 10%苓桂术甘汤含药血清组；F. 20%苓桂术甘汤含药血清组

图3苓桂术甘汤含药血清对H2O2损伤的心肌细胞凋亡形态的影响(Hoechst 33258染色，10×20倍)

3.4.2 苓桂术甘汤含药血清对H2O2损伤的心肌细胞凋亡率的影响 与正常对照组比较，H2O2模型组心肌细胞凋亡率显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与H2O2模型组比较，苓桂术甘汤含药血清组细胞凋亡率均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，苓桂术甘汤含药血清各组之间细胞凋亡率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。结果表明苓桂术甘汤含药血清可抑制H2O2损伤的心肌细胞凋亡。见图4。

3.5 苓桂术甘汤含药血清对H2O2损伤的心肌细胞氧自由基水平的影响 与正常对照组比较，H2O2模型组心肌细胞中氧自由基水平明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与H2O2模型组比较，苓桂术甘汤各含药血清组心肌细胞氧自由基水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；苓桂术甘汤含药血清各组之间氧自由基水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。表明苓桂术甘汤含药血清能显著降低H2O2诱导的心肌细胞氧自由基的释放，在一定范围内呈现浓度依赖性。见图5。

4 讨论

心室重构是AMI后常见的进行性病理过程，与心律失常、心力衰竭等不良预后密切相关[9]，氧化应激是导致心室重构和心力衰竭的重要因素[10]。研究表明，在缺血低氧条件下，氧自由基产生和清除的动态失衡，活性氧产生的速率大于被清除的速率，造成氧自由基的蓄积，氧自由基对细胞产生直接的损害，可导致心肌细胞凋亡而促进心室重构的发生[2-3，11]。

注：A.正常对照组；B. H2O2模型组；C. 20%空白大鼠血清组；D. 5%苓桂术甘汤含药血清组；E. 10%苓桂术甘汤含药血清组；F. 20%苓桂术甘汤含药血清组；与正常对照组比较，*P<0.05；与H2O2模型组比较，#P<0.05；与5%苓桂术甘汤含药血清组比较，△P<0.05；与10%苓桂术甘汤含药血清组比较，◇P<0.05

氧自由基和MDA是氧化应激的主要产物，其水平的高低反映细胞受自由基攻击和损伤的程度[12]。H2O2是体内氧自由基的一种，能自由通过细胞膜，与胞内的铁离子反应生成羟自由基等活性更强的自由基[13]，进而改变抗氧化酶的活性和细胞膜的通透性。GSH-Px和SOD是细胞内重要的抗氧化酶，GSH-Px可促进H2O2分解为O2和H2O，SOD可清除体内积聚的氧自由基，与氧化应激水平呈负相关。LDH是细胞内的糖酵解酶，广泛存在于细胞浆内，LDH漏出增加提示细胞遭到破坏或细胞膜通透性增加，其漏出量反映细胞膜的受损程度[14-15]。

注：A.正常对照组；B. H2O2模型组；C. 20%空白大鼠血清组；D. 5%苓桂术甘汤含药血清组；E. 10%苓桂术甘汤含药血清组；F. 20%苓桂术甘汤含药血清组；与正常对照组比较，*P<0.05；与H2O2模型组比较，#P<0.05；与5%苓桂术甘汤含药血清组比较，△P<0.05；与10%苓桂术甘汤含药血清组比较，◇P<0.05

本研究显示，在H2O2作用下，心肌细胞活力明显降低，细胞GSH-Px和SOD活性显著下调，LDH活性和MDA、氧自由基水平明显上调，细胞核浓染数目增加，细胞凋亡率明显升高，表明H2O2造成了心肌细胞氧化应激损伤和细胞凋亡；而苓桂术甘汤则能够提升H2O2诱导损伤模型心肌细胞GSH-Px、SOD的活性，降低细胞MDA、氧自由基水平和LDH活性，抑制心肌细胞凋亡，增强心肌细胞活力，提示苓桂术甘汤可通过提升抗氧化酶活性，提高细胞内氧自由基清除效率，改善H2O2诱导的氧化应激损伤，抑制心肌细胞凋亡，保护心肌细胞。

综上所述，本研究证实苓桂术甘汤可通过改善氧化应激水平而有效抑制心肌细胞损伤和凋亡，这一过程与苓桂术甘汤增强心肌细胞抗氧化酶活性和抑制细胞膜损伤有关，但其作用的具体途径尚不十分清楚，有待进一步研究。