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(海南大学食品学院,生物活性物质与功能食品开发重点实验室,热带多糖资源利用教育部工程研究中心,海南海口 570228)

椰子(CocosnuciferaL.)属棕榈科椰子属,是重要的热带油料作物,为人类提供食物、饮料、纤维、木炭和其他健康产品[1]。椰子果中富含多种营养成分,具有多种保健功能和较高的经济价值。椰子原产于亚洲东南部、印度尼西亚至太平洋群岛,中国广东南部诸岛及雷州半岛、海南、台湾及云南南部热带地区均有栽培。脱脂椰蓉是全脂椰蓉经榨油后剩余的部分,含有大量的纤维素和其他营养物质,但目前脱脂椰蓉主要作为废弃物,有效成分没有被充分发掘利用,经济效益低,不仅造成了生物质资源的严重浪费同时也造成了环境污染[2-3]。因此,如果将脱脂椰蓉进行深加工,降解其中难以消化的纤维,变废为宝,这对脱脂椰蓉产业资源利用和增加经济效益有着极为重要的意义。

亚临界水是介于其沸点和临界温度之间,并维持在适当的压力状态下的水[4]。亚临界水提法被广泛应用于副产物处理和动物饲料[5]。水在亚临界条件下具有与有机溶剂相似的性质,并且具有清洁无毒、反应速率快、转化率高[6-7]的优势,是环境友好型新技术。目前,赵岩等[8]研究了秸秆超(亚)临界水预处理与水解技术,李婧秋[9]对油棕果渣在亚临界水中的降解动力学做了评估,李幼梅[10]对番木瓜籽粕在亚临界水中的降解过程进行了研究、徐明忠等[11]研究了农业废弃物在亚临界降解过程中液态水水解动力学。但国内外尚未有脱脂椰蓉在亚临界水中降解的相关报道。本文通过对脱脂椰蓉亚临界水无催化降解过程研究,建立其动力学模型,得到降解过程中降解速率常数,以及降解过程的活化能,研究其降解途径,以期实现最大化利用脱脂椰蓉资源,提高产业附加值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

脱脂椰蓉粕 由海口市大白康健医疗有限公司提供;葡萄糖 西陇科学股份公司;3,5-二硝基水杨酸 分析纯,上海麦克林生化科技有限公司;混合单糖标准品:甘露糖,核糖,鼠李糖,氨基葡萄糖,葡萄糖醛酸,半乳糖醛酸,氨基半乳糖,葡萄糖,半乳糖,木糖,阿拉伯糖 Sigma公司。

HB43-S水分测定仪 梅特勒托利多仪器有限公司;723PC型可见分光光度计 上海奥普勒仪器有限公司;AII研磨机 广州仪科实验室技术有限公司;EL204型电子天平 梅特勒托利多仪器有限公司;CS101-1B电热鼓风干燥箱 重庆四达试验设备有限公司;PHS-3D pH计 上海精密科学仪器有限公司;Agilent 1100高效液相色谱仪,配DAD检测器 安捷伦科技有限公司;亚临界设备 由课题组自行设计,其装置如图1所示,该装置分为温度控制系统、加热系统和高温反应釜。温度控制系统是可控硅调温器,配有高灵敏度温度探头,控温精度±1 ℃;加热系统(石棉加热套)最高加热温度为300 ℃;高温反应釜(不锈钢材料),内含量定做的为150 mL,最高可承受400 ℃的高温以及10 MPa压力。

图1 亚临界装置简图Fig.1 The scheme of subcritical water experiment device注:1:控温仪;2:温度探头;3;压力表;4:高压阀门;5:反应釜;6:加热套。

1.2 实验方法

1.2.1 脱脂椰蓉粉的制备 脱脂椰蓉粕置于45 ℃烘箱中干燥24 h,粉碎得到粉末即为脱脂椰蓉粉,取250 μm(60目)的部分装入密封袋中,作为实验原料样品,置于12 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 脱脂椰蓉粉成分测定 灰分测定:GB 5009.4-2016,水分测定:GB 5009.3-2010,纤维素、半纤维素、木质素测定:范式Van Soest分析法[12]。

1.2.3 脱脂椰蓉粉的亚临界降解 精确称取脱脂椰蓉粉2 g,放入亚临界反应釜中,按质量体积比1∶30(按经济、能源角度和水解率综合考虑)加蒸馏水,密封反应釜。设置加热套至实验所需温度,温度达到后将反应釜放入,等反应釜温度升至设定温度(100、120、140、160、180和200 ℃)后,计时,待反应时间(10、20、30、40、50和60 min)达到后,将反应釜取出放入冷水(4 ℃)中迅速冷却,反应后固液混合物,过滤分离得到降解液和降解产物,降解液进行真空抽滤,测其滤液的pH及还原糖浓度;降解产物于45 ℃烘箱中干燥24 h后称重,记录。

1.2.4 产物还原糖的测定

1.2.4.1 3,5-二硝基水杨酸(DNS)反应液的制备 准确称取3,5-二硝基水杨酸6.3 g,加2 mol/L的NaOH 260 mL,摇匀后加入酒石酸钾钠水溶液(370 g/L),5 g亚硫酸钠和5 g苯酚(60 ℃水浴下进行),最后定容至1000 mL,暗处存放7 d后使用[13]。

1.2.4.2 葡萄糖标准溶液的绘制 取0.1 g葡萄糖定容至100 mL,得到浓度为1 mg/mL的葡萄糖标准溶液。取6支试管,分别加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL葡萄糖标准溶液,蒸馏水补足至1 mL,加入1.5 mL DNS试剂,补足至3 mL,摇匀后,沸水浴反应5 min,反应结束后冷却至室温,加入7 mL蒸馏水于540 nm处测吸光值。以葡萄糖浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线,标准曲线为y=0.83714x+0.0905,决定系数R2=0.995,线性范围在0～0.5 mg/mL。

1.2.4.3 还原糖产率的计算 将降解后的滤液稀释10倍,取1 mL加入1.5 mL DNS试剂,补足至3 mL,摇匀后,沸水浴反应5 min,反应结束后冷却至室温,加入7 mL蒸馏水于540 nm处测吸光值。根据标准曲线计算降解液中还原糖产率(Ys):

式(1)

式中:n-稀释倍数;c-还原糖浓度(g/L);v-降解液体积(mL);m0-脱脂椰蓉残渣中半纤维素含量(g);1000-单位换算。

1.3 动力学模型建立

由于高温液态水表现出一定的酸催化特性,半纤维素在高温液态水中水解为一级连串反应,半纤维素首先水解为聚糖,然后进一步分解为单糖,当反应条件剧烈时被进一步降解为糠醛等副产物,所以用稀酸催化水解半纤维素的动力学模型来表示[14]。

目前,国内外研究者利用Saeman模型对木质纤维素类生物质进行亚临界水降解研究[15-17],主要发生以下反应:

半纤维素→低聚糖→单糖→降解物

式(2)

该模型是目前最常用的植物水解动力学模型,在动力反应计算时,将得到还原糖的量作为水解生成糖的总量,建立一级连串均相反应模型:

式(3)

式中:k1-脱脂椰蓉粉降解为还原糖的反应速率常数(min-1),k2-还原糖分解的反应速率常数(min-1)。反应速率方程如下:

式(4)

式(5)

式(6)

式中:Ch-脱脂椰蓉粉半纤维素浓度(g/L),Cs-还原糖浓度(g/L),Cd-还原糖降解产物的浓度(g/L)。

根据质量守恒定律:

Ch+Cs+Cd=Ch0

式(7)

式(8)

式(9)

式中:Ch0-脱脂椰蓉半纤维素降解前的初始浓度(g/L)。

可算出: Ch=Ch0exp(-k1t)

式(10)

式(11)

设t=0时,Cs=0,整理得:

式(12)

则还原糖产率为:

式(13)

1.4 动力学参数的确定

将脱脂椰蓉粉降解实验数据Ch、Cs、Cd带入方程(13),通过曲线拟合求解得出100、120、140、160、180、200 ℃的速率常数k1和k2。将k1和k2代入Arrhenius方程[18]:

式(14)

式中:Ki0-指前因子(min-1),Eai-反应活化能(kJ/mol),R-气体常数,8.314J/(mol·K),T-降解温度(K)。

方程两边取对数:lnKi=lnKi0-Eai/(RT),可以看出lnKi与1/T是线性关系的。对lnKi与1/T做一条拟合的直线,得到拟合直线方程。方程的截距为指前因子Ki0,斜率为反应活化能Eai。

1.5 脱脂椰蓉降解物形态学表征方法

1.5.1 固体残渣转化率 经亚临界降解后,抽滤使固液分离,计算脱脂椰蓉粉在不同降解温度及降解时间下的转化率。

固体残渣率:

式(15)

脱脂椰蓉粉转化率:

Yt=1-Ym

式(16)

式中:m-降解后固体残渣质量(干燥),g;M-原料质量,g。

1.5.2 扫描电镜样品的制备(SEM) 分别取不同降解温度及降解时间下的适量脱脂椰蓉粉和亚临界降解的脱脂椰蓉残渣样品,反应温度为均匀分散在导电板上,用IB-5型离子溅射仪喷金镀膜,对不同处理条件下的样品进行微观结构观察。

1.5.3 红外光谱分析 分别准确称取干燥的脱脂椰蓉粉和160 ℃,30 min下的降解产物各1 mg于玛瑙研钵中,加入100 mg干燥的KBr晶体,在红外灯照射下研磨至极细混匀,用压片机压片,制成一定直径和厚度的透明片,于红外分光光度计400～4000 cm-1中红外区扫描,测定红外光谱曲线。

1.6 脱脂椰蓉降解产物分析

1.6.1 HPLC-单糖组成 脱脂椰蓉粉及降解物(160 ℃降解30 min)单糖组成经高效液相色谱分析后,先转化为1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生物,采用Honda等[19]的方法进行单糖分析。

取浓度为250 mg/L的混合单糖标准液400 μL于5 mL的具塞试管中,加400 μL PMP甲醇溶液,漩涡混匀;于70 ℃水浴中反应2 h;取出冷却至室温;加400 μL 0.3 mol/L的盐酸中和;加200 μL蒸馏水,再按1∶1等体积加入氯仿,涡旋混匀振摇,静置后弃去氯仿相,萃取2次;将水相用0.45 μm微孔膜(水系)过滤后供HPLC进样分析。

1.6.2 样品水解液的制备 称取10～20 mg降解液于10 mL的钳口瓶中,加入5 mL的2 mol/L TFA,充N2封管,在110 ℃烘箱中水解6 h;冷却后开盖取2 mL加入1 mL甲醇于70 ℃水浴下用N2吹干,重复加甲醇并用N2吹干2次(去除TFA);加入2 mL 0.3 mol/L NaOH溶液充分溶解残渣,即为样品多糖水解液。

1.6.3 HPLC检测条件 色谱条件:色谱柱C18柱,250 mm×4.6 mm,粒度5 μm;流动相A:100 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH=6.4);流动相B:乙腈;检测波长:250 nm;柱温30 ℃;流速1 mL/min;进样量5 μL。

1.6.4 降解液pH 测试前校正pH计,测定降解液的pH。

1.7 数据统计分析

采用Excel 2010软件进行统计处理,所有数据为3次重复的平均值和标准差。采用Origin软件进行绘图,并应用DPS软件对数据进行差异性分析。

2 结果与分析

2.1 脱脂椰蓉粉成分分析

由表1可知,脱脂椰蓉粉中半纤维素质量分数由34.75%降至10.90%,木质素质量分数由7.89%降至7.44%,而纤维素的质量分数则由27.5%升至60.2%,由此可说明脱脂椰蓉粉经亚临界处理主要破坏的是半纤维素和木质素,木质素为芳香族环状化合物,结构破坏后不能直接转化为还原糖,而半纤维素由于其结构同时含有五碳糖和六碳糖的杂多糖,可部分转化为还原糖[20]。

表1 样品的主要成分(%)Table 1 Main components of the samples(%)

2.2 亚临界水降解动力学参数的确定

2.2.1 还原糖产率测定结果 不同温度下脱脂椰蓉粉亚临界水中降解还原糖产率实验值(Experimental value,Exp)与计算值(Calculated,Cal)随时间的变化如图2所示。由图2可以看出,反应温度和降解时间还原糖产率有明显影响。在100和120 ℃图中还原糖产率随着降解时间的增大而增大,降解温度140 ℃时还原糖产率先增加后呈现平缓的趋势,当降解温度为160 ℃及更高时,还原糖的产率先随降解时间增大而增大,达到峰值后随降解时间的增大而降低。原因是高温条件下脱脂椰蓉粉成分中的半纤维素在较短时间内就完成降解,而后还原糖产量下降可能是脱脂椰蓉粉成分中的半纤维素基本降解完全,此时的温度又不足以打断纤维素的糖苷键,因此反应过程中还原糖生成量低于还原糖降解量[5]。

图2 不同温度下的还原糖产率Fig.2 Yield of reducing sugar at different temperature

从图中还可看出反应温度在140、160、180和200 ℃时,还原糖产率都达到峰值,且峰值大致相同,达到峰值的时间随温度升高而增快。相同反应时间下,180和220 ℃还原糖产率达到峰值的时间太快,且保持时间短,因此在实际生产中选取反应温度为160 ℃。

在本实验考察的反应温度下,实验点与模型计算值的吻合度高,其中160 ℃下模型拟合所得曲线与实验值拟合度R2>0.98,说明用Saeman模型作为脱脂椰蓉的降解动力学模型是合理的,半纤维素的降解行为遵循一级连串反应动力学模型。

2.2.2 动力学模型参数的确定 将k1,k2实验数据代入Arrhenius方程,得到lnKi与1/T的拟合直线。如图3所示。

表2 脱脂椰蓉不同温度下亚临界水降解的k1,k2值Table 2 Values of k1 and k2 under different temperature of defatted coconut flour fiber in subcritical water

图3 脱脂椰蓉粉亚临界水降解lnk与1/T的关系Fig.3 Defatted coconut flour in subcritical water degradation lnk relationship with 1/T

取拟合直线方程的截距和斜率用做求指前因子Ki0和反应活化能Eai,结果如表3所示:

表3 亚临界水降解脱脂椰蓉粉的指前因子和反应活化能Table 3 Finger-leading factors and reactive activation energy of defatted coconut flour fiber in subcritical water

表3中的数据代入Arrhenius方程得:

K1=6.50×102exp[-35.94×103/RT]

K2=3.24×102exp[-32.12×103/RT]

2.3 温度与时间对脱脂椰蓉粉转化率的影响

由图4可知,亚临界水的温度对脱脂椰蓉粉的转化具有非常明显的影响,在降解时间10 min,温度由100 ℃升至200 ℃时,脱脂椰蓉粉转化率由23.0%升高至56.2%,转化率提高了59.07%。在降解时间60 min,温度由100 ℃升至200 ℃时,脱脂椰蓉粉转化率由34.01%升高至76.20%,转化率提高了55.38%。由此可知,反应温度升高可提高转化率。

图4 降解温度和时间对脱脂椰蓉粉转化率的影响Fig.4 Effects of degradation temperature and time on defatted coconut flour fiber conversion

在反应温度为100 ℃时,反应时间由10 min延长至60 min时,转化率由 23.0%升高至60.34%,转化率提高了61.88%。由此可知,延长反应时间也可提高转化率。据上述,不同反应温度下,温度越高,转化率越大,相同反应温度条件下,延长反应时间可提高转化率。

2.4 脱脂椰蓉残渣亚临界水降解过程形态学变化

2.4.1 不同降解温度和时间的扫描电镜变化 在反应时间为30 min,料液比为1∶30的固定条件下,得到原样和100～200 ℃ 温度降解后的固态产物表观形态学,如图5所示:

图5 脱脂椰蓉粉及其各降解时间固态产物的扫描电镜图(1000×)Fig.5 SEM of defatted coconut flour fiber and it’s degradation products in different time in subcritical water(1000×)

由图5可知,经100 ℃降解后的固态产物开始产生缝隙,覆盖在表面的片状结构物开始出现剥落现象,并开始形成早期骨架连接物的雏形。120 ℃表面开始变的不再光滑,形成具有孔状的骨架连接物。140 ℃固态产物形态中的骨架连接物的骨架之间有断开状,断口呈无规则状,孔洞多而繁密。160 ℃固态产物的骨架状物质变得稀薄;180 ℃固态产物呈稀疏、断层的无规则状;200 ℃的固态产物中的骨架连接物断裂,呈稀碎、无规则堆积状。

在反应温度为160 ℃,料液比为1∶30的固定条件下,得到原样和10～60 min降解时间后的固态产物表观形态学,如图6所示:

图6 脱脂椰蓉粉及其各温度降解后固态产物的扫描电镜图(1000×)Fig.6 SEM of defatted coconut flour fiber and it’s degradation products in different temperature in subcritical water(1000×)

图6为脱脂椰蓉粉与降解物进行微观形态学的对比图,由图可知,不同降解时间下固态产物呈现的表观形貌不同。反应10 min时,片状结构物开始聚集,表面凹凸物初步剥落,表面变的光滑,反应20 min时,生成骨架连接物,并开始出现孔洞。反应30～40 min时,可观察到物质结构开始模糊,有融合团聚现象。反应50 min时,骨架连接物断裂,孔洞开始增多而密,完整的断裂骨架物基本上被打成小碎片;反应60 min时,物料之间堆积较疏松,稀碎,松散。

对比脱脂椰蓉粉原样,经不同温度亚临界降解后的样品结构均发生了不同程度的改变,温度越高,骨架连接物之间开始断裂,演变成骨架稀薄、并出现孔洞,最终形成稀碎、无规则形状的堆积物。实验结果表明,脱脂椰蓉粉在亚临界水中发生了降解。

2.4.2 脱脂椰蓉粉及降解物的红外光谱图 为进一步分析亚临界水对脱脂椰蓉粉与降解物结构的影响,对脱脂椰蓉粉和降解物(160 ℃降解30 min)做了红外光谱实验。由图7(b)可知,在 808、1012、1240、1452、2328 cm-1处的特征吸收峰消失,在607、650、1508、1321、1541、1571、2368、3371.57 cm-1处出现了新的特征吸收峰,据此可知,脱脂椰蓉粉在亚临界水中发生了降解反应。

图7 脱脂椰蓉原样及降解产物的红外光谱图Fig.7 Infrared spectrogram of defatted coconut flour and degradation products注:a:原料;b:降解产物。

其中,1541.12和1452 cm-1处是木质素结构中苯环的吸收峰,说明表示样品中存在芳香族类有机物;2924.09 cm-1处有一较强吸收峰,此峰为糖类亚甲基上C-H的伸缩振动;1456.26 cm-1处的小尖峰是O-H的变形振动,1246.02、1321.21、1377.17 cm-1处为C-H的变角振动,这些峰都是糖类的特征吸收峰;1747.51 cm-1处为半纤维素C=O的伸缩振动,1157 cm-1处是半纤维素和木质素的C-O-C伸缩振动,1060 cm-1是半纤维素和纤维素中C-O的伸缩振动;806.26、871.82 cm-1处表明降解物中含有a-型吡喃糖[21-23]。

2.5 脱脂椰蓉粉降解产物分析

2.5.1 单糖组分分析 对脱脂椰蓉粉和降解物(160 ℃降解30 min)做单糖组分的分析,结果如图8所示:

图8 脱脂椰蓉粉及其降解后固态产物的单糖组成Fig.8 Monosaccharide composition of defatted coconut flour and it’s degradation products

由图8可知,经亚临界降解后,降解产物单糖的绝对含量发生了显著的变化,获得富含纤维素的残渣。经降解后的单糖主要有甘露糖和半乳糖组成。其中鼠李糖半乳糖醛酸、氨基半乳糖、木糖经亚临界水降解后消失,甘露糖由原料中的502.38 mg/L升高至848.49 mg/L,核糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、半乳糖、阿拉伯糖的绝对含量均有大幅度下降,分别由506.87、463.48、499.26、499.98、471.94 mg/L下降到27.01、19.74、69.05、333.11、50.97 mg/L。这可能是因为有一部分在亚临界水条件下难以水解的纤维组织中所含单糖的组成与原料中的不同所致。

2.5.2 降解液pH变化 由图9可知,降解液的pH随着降解时间的延长,而逐渐下降;在前10 min内下降趋势明显,而后渐变平缓。温度越高,pH下降的速率越快,这是因为亚临界条件下随温度升高,水分子间的相互作用越强烈,从而加速催化降解反应速率,温度越高,催化越明显,降解速率越大。pH下降的原因是因为脱脂椰蓉残渣的半纤维素中含有乙酰基团,反应初期水解产生了大量乙酸[24-26]。

图9 降解液pH变化Fig.9 Changes of pH of hydrolysate

3 结论

Saeman模型拟合相关系数较高,能很好地反映了脱脂椰蓉粉亚临界水降解的途径。在亚临界水解条件下脱脂椰蓉纤维降解反应活化能为35.94 kJ/mol,还原糖降解活化能为32.12 kJ/mol,指前因子分别为6.50×102和3.24×102。降解产物形态学可知,在不同的亚临界水条件下,脱脂椰蓉粉转化率不同,反应温度越高,可缩短降解时间,反应温度低可通过延长反应时间提高转化率,在SEM下降解后的产物随亚临界水降解温度的提高堆叠程度疏松,演变成骨架稀薄的薄膜状;降解物的红外结构显示了多糖的典型特征。