靳文娟，谢娟平，鱼亚楠，王 磊

(安康学院 秦巴中药资源研发中心, 陕西 安康 725000)

安康紫阳属于中国最古老的北缘茶区，种茶历史悠久，始于商周，兴于盛唐，是中国最早的贡茶产地，加之紫阳地区土壤富硒，茶叶达到了富硒标准，紫阳富硒茶品质优良[1]。紫阳县现有茶园面积1.47万hm2，年产茶叶7 000余t，发展茶企300余家，茶叶的深加工是提高紫阳富硒茶综合利用的有效途径之一[2]。

绿茶的主要活性物质中，茶多酚(TP，约占茶叶干重的15%～25%)是形成茶叶色香味的主要成份之一，也是茶叶中有保健功能的主要成份之一，具有强的抗氧化和抗辐射作用[3]；茶氨酸(N-乙基-L-谷氨酰胺)是茶叶中特有的游离氨基酸，在干茶中占重量的1%～2%，具有调节脑内神经传达物质的变化、降血压等作用[4～5]。

目前，茶多酚提取多以50%～70%的乙醇[6]或蒸馏水超声辅助提取[7～8]、微波辅助提取[9]或超临界流体提取[10]等为主，以高浓度(80%)乙醇冷浸提取的报道较少，茶氨酸的提取主要以加热蒸馏水提取为主[11～13]，为了提高茶氨酸的提取率，综合考虑茶多酚的提取，笔者设计了80%乙醇冷浸提取和超声波辅助提取相结合的分级提取工艺，同时，设计分离纯化工艺[14～15]，分别得到了茶多酚和茶氨酸粉末，为提高安康紫阳富硒茶的综合利用率提供实验参考。

1 实验部分

1.1 实验仪器与试剂

超声波清洗器KH2200E(超声频率40KHz,超声功率80W，加热功率600W)昆山禾创超声仪器有限公司；旋转蒸发仪，RE-52AA，上海雅荣生化仪器设备有限公司，傅立叶红外光谱仪FT-IR200美国Nicolet公司，双光束紫外-可见分光光度计，SP-1900，上海光谱仪器有限公司，高效液相色谱SPD-10AVP 日本岛津，玻璃器包括：渗漏器、分液漏斗等。

茶叶为陕西省安康市本地紫阳富硒茶，茶氨酸标品购自北京索来宝生物科技有限公司；二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、茚三酮、氯化亚锡、丙酮、溴化钾、甲醇均为分析纯，购自天津市百世化工有限公司，聚酰胺(200-400目)树脂、732型阳离子交换树脂购自天津市科密欧化学试剂有限公司、DEAE纤维素DE-52树脂购自北京博奥拓达科技有限公司。

1.2 实验过程

1.2.1 茶多酚、茶氨酸的分级提取分离 取低温烘干后的茶叶5.0 g，粗粉碎(过60目筛)，以料液比为1:25入80 % 的乙醇溶液125 mL于渗漏器中，浸泡24 h后，收集初漏液，再添加80% 的乙醇溶液，渗漏速度2 mL·min-1，收集续漏液，合并两次渗漏液，0.08 MPa、50 ℃减压浓缩，回收乙醇。

滤渣烘干后，称重为3.1207 g，加入100 mL蒸馏水，在超声波辅助条件下，70 ℃提取30 min，过滤，滤渣再加入50 mL蒸馏水，同样条件下提取30 min，合并滤液，0.08 MPa、75 ℃减压浓缩。

1.2.2 冷浸提液中茶多酚和茶氨酸的分离纯化 乙醇冷浸提取浓缩液用等体积乙酸乙酯萃取两次，取上层液体减压浓缩，回收乙酸乙酯后，逐滴滴加过预处理过的聚酰胺树脂，柱内保留时间为30 min，先用1.5倍体积的去离子水洗脱去除咖啡因，再用1.5倍柱体积的85%乙醇洗脱，将洗脱液用胶头滴管每次吸取少量液体逐滴滴加过AB-8树脂，柱内保留时间30 min，用1.5倍柱体积的85%乙醇洗脱得到淡黄色液体，减压浓缩回收乙醇，减压浓缩，低温干燥得到茶多酚粉末0.7420 g，得率14.84%。

乙酸乙酯萃取后的下层萃取液，减压蒸馏，去除少量乙酸乙酯后，过732型阳离子交换树脂，用pH=8的磷酸盐溶液洗脱，收集洗脱液。

1.2.3 滤渣超声水提液中茶氨酸的分离纯化 将80%乙醇浸提后的茶叶渣(3.1207 g)，加水80 mL、70℃超声辅助浸提50 min，提取2次，取滤液减压浓缩后过DEAE树脂，柱内保留时间为30 min，流出液用胶头滴管每次吸取少量液体逐滴滴加至732型阳离子交换树脂，用pH=8的磷酸盐溶液洗脱，得到洗脱液为茶氨酸富集液，合并冷浸提液萃取柱分离处理后的洗脱液，低温烘干，得到白色粉末0.0407g，得率0.814%。

图1 茶多酚、茶氨酸的分级提取、分离纯化流程

1.3 红外光谱表征

采用KBr压片法，分别对从安康紫阳富硒茶中分级提取分离得到的茶多酚样品、茶氨酸样品进行红外光谱分析，明确特征官能团的吸收峰。

1.4 含量的测定

1.4.1 茶多酚含量测定 建立高效液相色谱法条件，对乙醇冷浸提液和超声水提取液中茶多酚的含量进行分析。高效液相色谱条件：C18色谱柱，柱温25 ℃，紫外检测器，检测波长279 nm，流动相：A:甲醇；B:0.1%磷酸水溶液(A:B = 28:72)，流速1.0 mL·min-1。

标品溶液的制备：精密称取茶多酚标品粉末25.0 mg，于50 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶解后，置于超声条件下30 min，定容，以0.45μm 微孔滤膜滤过，滤液作为样品储备液备用。标准曲线测定，分别取标品储备液1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL、12 mL定容至25 mL，取10μL 进样。

样品溶液的制备：冷浸提液和超声水提取液，各取10 mL，以0.45μm 微孔滤膜滤过，滤液作为样品供试液，取1μL 进样。

1.4.2 茶氨酸含量的测定 采用茚三酮比色法测定茶氨酸的含量。

标品的制备：准确称取茶氨酸标品5.0 mg，加1 mL蒸馏水加热溶解，定容至25 mL。

茶氨酸标准曲线：分别取标品溶液0、1、2、3、4、5 mL，加PH=8的磷酸盐缓冲溶液2 mL，2%茚三酮溶液 1mL，沸水加热15 min，自然冷却10 min，加蒸馏水定容至25 mL，570 nm处测吸光度。

分别取冷浸提液3 mL、超声水提取液3 mL，加缓冲溶液2 mL，2%茚三酮溶液 1mL，沸水加热15 min，自然冷却10 min，加蒸馏水定容至25 mL，570 nm处测吸光度。

2 结果与讨论

2.1 红外光谱分析

对分级分离纯化后所得的茶多酚和茶氨酸粉末进行红外光谱分析。

茶多酚样品的红外光谱图如图2所示，在3 200～3 600 cm-1的宽吸收峰为苯环上的羟基吸收峰，1 300～1 350 cm-1是茶多酚中表儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素没食子酸酯的酯基吸收峰，1 000～1 300 cm-1左右为羟基的变形振动，700～850 cm-1处可能是由1,3二取代苯上的-C-H变形振动产生的吸收峰。

茶氨酸样品的红外光谱图如图3所示，3 300～3 500 cm-1的吸收峰为酰胺键上N-H的伸缩振动，2 850～3 000 cm-1的宽吸收峰为-CH3基、-CH2基的伸缩吸收，1 500～1 750 cm-1的吸收峰为C=O的伸缩振动，1 000～1 350 cm-1左右为C-N伸缩振动吸收。

图2 茶多酚样品红外光谱

图3 茶氨酸样品红外光谱

2.2 含量测定数据及分析

2.2.1 茶多酚标品的高效液相图谱及标准曲线

图4 茶多酚标品的高效液相图谱

图5 茶多酚标品的标准曲线

在本实验建立的高效液相条件下，测得茶多酚标品的高效液相色谱图如图4所示，共有7个峰反应了茶多酚的主要组成，采用保留时间定性，面积加和后进行外标法计算含量，茶多酚标准曲线如图5所示，根据标准曲线可得到乙醇浸提液和超声水提液中茶多酚的含量分别为0.7162 g(占茶叶原重的14.32%)和0.03949 g(占茶叶原重的0.7898%)。

2.2.2 茶多酚和茶氨酸的含量分析 由表2的数据可见，采用80%乙醇提取和超声辅助水提的分级提取方法，在乙醇浸提液中茶多酚的含量为716.1132 mg，茶氨酸的含量为11.7589 mg；超声滤渣超声水提液中茶多酚的含量为39.4878 mg，茶氨酸的含量为38.4665 mg。实验共称取了5.0 g 安康紫阳富硒茶，采用分级提取的方法可知：茶多酚的总含量为755.6010 mg，占茶叶总重量的15.11%；茶氨酸的总含量为50.2254 mg，占茶叶总重量的1.005%。

表1 茶多酚含量的高效液相数据

表2 茶多酚、茶氨酸含量数据

注：百分提取率为含量占茶叶原质量的百分数。

3 结论

茶多酚和茶氨酸是茶叶的主要活性物质，也是提高茶叶综合开发利用价值的主要产品，安康茶叶资源丰富，紫阳富硒茶(绿茶)是安康茶叶中的佼佼者，为了提高其中茶多酚和茶氨酸的综合提取率，本文设计了乙醇(85%)冷浸提取和超声水提相结合的分级提取方式，建立了高效液相分析法和茚三酮显色法分析法相结合的表征方法，分别检测分级提取液中茶多酚和茶氨酸的含量，可为下一步分离纯化提供数据基础。

分析得到的含量数据可知：冷浸提法一级提取液中茶多酚的含量高，占到茶叶干重的15.11%，同时有少量茶氨酸可从中分离得到；冷浸提后的滤渣经过超声辅助水提后，可得到二级提取液，其中茶多酚的含量低(占茶叶干重的0.7898%)，茶氨酸含量占茶叶干重的1.005%。提取液经萃取和柱分离相结合的方式纯化后，干燥，得到茶多酚粉末0.7420 g，得率14.84%，茶氨酸白色粉末0.0407g，得率0.814%。该分级提取工艺实现了茶多酚和茶氨酸的综合提取，提取效率高，设备简单，可操作性强，具有一定的小试放大价值。