陈 颐，赵应伟，徐安传，郑志云，高德富，王 飞，王津军，邹聪明，李天福*

(1.云南省烟草农业科学研究院，云南 昆明 650031；2.云南省香料烟有限责任公司，云南 保山 678000；3.云南中烟工业有限责任公司，云南 昆明 650202；4.云南省烟草公司玉溪市公司，云南 玉溪 652800；5.云南省烟草公司昆明市公司，云南 昆明 650000；6.福建省烟草公司三明市公司，福建 三明 365000)

【研究意义】烟叶的采收成熟度是影响烟叶品质和外观质量的重要因素，也是烤烟分级标准中考虑的第一要素[1-2]。由于生产中对烟叶的采收成熟度把握不准，存在青烟采烤现象，烤后烟叶化学成分不协调，抽吸质量表现为香气质差、香气量不足，刺激性明显，青杂气略重，潜在质量特征未充分彰显，烟叶内在品质有较大提升空间[3-4]。【前人研究进展】美国、巴西、津巴布韦等国外优质烤烟生产区生产混合型烤烟，对烟叶原料的成熟度要求较高，也试图找到科学精准反映烤烟成熟标准的内外在特征[5]。其中日本采用比色卡来判断烟叶成熟度，生产实践中不易操作[6]；美国采用烟叶采收时的茎叶夹角以及叶柄是否带茎皮等方法来判断，仍不够精准[7]；而中国判断烟叶成熟度的方法大多数是依据烟叶颜色、外观特征等方面，上述研究大多局限在外观特征的描述上，以颜色变化作为依据，主观因素大，对鲜烟叶成熟特征缺乏定量判断标准[8]。【本研究切入点】笔者以鲜烟叶的植物学特性为基础，并分析不同采收成熟度下鲜烟叶光合特性、主要化学成分、组织结构、细胞超微结构对初烤烟叶产值、产量、内在化学成分以及感官质量的影响，筛选出产质量高、化学成分协调的处理，然后进行反推，最终确定能表征K326产质量高的成熟度鲜烟叶素质指标及参数，从而提高烟叶的易烤性。【拟解决的关键问题】为巩固云南省优质特色烟叶K326原料优势提供新的思路和方向，对促进云南两烟持续发展具有重要的现实意义和战略意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料和地点

供试品种为K326，由玉溪中烟种子有限责任公司提供。试验于2015和2016年在云南省玉溪市华宁县宁州镇董家山(海拔1647 m，N 24°11′42″，E 102°55′31″)进行。前茬作物为玉米，土壤类型为红壤，肥力水平中等，基本理化性状：pH 6.40，有机质10.7 g/kg，碱解氮82.0 mg/kg，速效钾160.0 mg/kg，速效磷90.0 mg/kg。

1.2 试验设计

试验采取随机区组排列，共设3个处理，重复3次，共9个小区，小区面积66.7 m2，植烟110株，行距1.2 m，株距0.5 m，合理设置保护行，以减少试验误差。采用膜下小苗移栽，时间4月19-24日。移栽时施N∶P2O5∶K2O(12∶6∶24)的烤烟专用复合肥75 kg/hm2，栽后10～15 d施提苗肥，35 d揭膜培土，65～70 d封顶，打顶后7 d选取田间长势一致的10株烟跟踪取样。以当地的实际情况进行采收，以中部叶为试验材料，按尚熟、适熟和过熟3种成熟度田间鲜烟叶取样。其处理为：处理1(尚熟)：正常采烤当天，栽后(85±2)d；处理2(适熟)：正常采烤后6～7 d，栽后(92±2)d；处理3(过熟)：正常采烤后10～12 d，栽后(97±2)d。

1.3 检测项目与方法

植物学特性分析：鲜烟叶成熟期植物学特性指标有叶色、叶表面及茎叶角度、主脉色泽、支脉色泽、成熟斑、茸毛脱落程度、叶尖叶缘变化情况等。

光合特性分析：于烤烟成熟期每小区各处理随机选择10片烟叶，测定叶片SPAD值。

化学成分分析：烟叶成熟后，每小区各个处理取中部鲜烟叶各20片，杀青后按烟草行业标准[9-13]检测鲜烟叶的含糖化合物(总糖、还原糖、淀粉等)和含氮化合物(总氮、烟碱、蛋白质等)；每小区各个处理取C3F初烤烟叶各3 kg，按烟草行业标准方法[9-13]测定初烤烟叶的常规化学成分(总糖、还原糖、烟碱等)。

石蜡切片的取样方法：剪取所取样品的中脉两侧约0.5 cm×0.5 cm 的小块，材料用FAA固定，常规石蜡切片法，切片厚度为10 μm，苏木精染色，加拿大树胶封片，制成永久制片。用显微镜观察拍照[14]。

扫描和投射电镜的取样方法：取样时，避开叶片主脉和大的侧脉、剪取不同成熟度的烟株中部叶，剪成3 mm×3 mm，置于青霉素小瓶中，使叶片充分浸泡在4 %戊二醛固定液中固定，于4 ℃保存，用于后续透射电镜的观察，观测指标为全细胞、叶绿体等超微结构[15]。

经济性状分析：依据GB/2635-1992，测定每个小区烤烟的实际产量、产值、均价和中上等烟比例。

感官质量分析：烟叶样品的感官质量由红塔集团技术中心进行评价分析。

1.4 数据统计

所有数据均采用EXCEL、SPSS17.0等分析软件进行方差分析、计算和统计作表。

2 结果与分析

2.1 不同成熟度鲜烟叶植物学特性比较

3个成熟度的植物学特性见表1，随着烟叶成熟度的提高，烟叶的颜色由绿黄向黄色转变，最终变成黄白；主脉和支脉的颜色逐渐变白，其中主脉由尚熟的40 %提高到80 %，同样支脉则由尚熟的20 %提高到60 %；烟叶茎叶夹角增大，叶尖下勾和叶缘下卷幅度增大；成熟斑变多，由尚熟的50 %提高到90 %，茸毛脱落增多，由尚熟的不脱落提高到脱落75 %。

2.2 不同成熟度鲜烟叶光合特性及主要化学成分比较

叶片SPAD值取决于叶绿素对特定波段光线的吸收，读数越大说明叶绿素含量越高[16]。从表2可知，不同成熟度鲜烟叶SPAD值存在极显著差异(P<0.01)，其中尚熟鲜烟叶SPAD值显著高于适熟和过熟，表明鲜烟叶叶绿素含量随烟叶成熟度提高而显著下降。

表1 不同处理下K326鲜烟叶植物学特性分析

表2 不同处理下K326鲜烟叶SPAD值和主要化学成分分析

注：同列不同小写字母表示差异达5 %显著水平，同列不同大写字母表示差异达1 %显著水平，下同。

Note: Different lower case letters in the same column mean significant difference at 5 % level. Different capital letters in the same column mean significant difference at 1 % level. The same as below.

不同成熟度处理下鲜烟叶总糖、还原糖、淀粉和蛋白质含量存在极显著性差异(P<0.01)。K326鲜烟叶总糖含量和还原糖含量大小表现为适熟>尚熟>过熟，而在淀粉含量上表现为尚熟>适熟>过熟。K326鲜烟叶蛋白质含量大小表现为适熟>尚熟>过熟，表明不同成熟度处理对鲜烟叶含糖化合物和含氮化合物产生了较大影响。

2.3 不同成熟度鲜烟叶组织结构比较

由表3可知，不同成熟度处理下K326鲜烟叶栅栏组织厚度和海绵组织厚度存在极显著性差异(P<0.01)，指标大小均表现为适熟期>过熟期>尚熟期。由此可见，尚熟期、适熟期和过熟期烟叶组织细胞形态差异很大，其中适熟期烤烟品种K326的栅栏组织厚度为58.94 μm，海绵组织厚度为68.54 μm。

2.4 不同成熟度鲜烟叶细胞和叶绿体超微结构比较

由图1细胞超微观察结果显示：尚熟期鲜烟叶细胞轮廓清晰，结构完整，细胞壁与细胞膜紧密相连，没有质壁分离现象，细胞排列整齐；适熟期烟叶细胞超微结构与尚熟期相似，不同的是细胞间存在少量间隙，间隙度较尚熟烟叶大，间隙适度，烟叶更有弹性；过熟期鲜烟叶整体细胞结构完整，细胞壁与细胞膜紧密相连，细胞壁平滑，没有发生皱缩，但细胞间的间隙程度较尚熟期和适熟期的烟叶大。

叶绿体超微观察结果显示：尚熟期鲜烟叶可以在细胞中清晰的观察到叶绿体的超微结构，叶绿体结构完整，双层膜轮廓清晰，内部基粒结构清楚，基粒个数较多，每个基粒的类囊体数量较多，基粒片层完整，叶绿体中有大量淀粉颗粒的积累，但淀粉颗粒较小，显示为积累初期，叶绿体沿着细胞壁分布为椭圆形。适熟期烟叶叶绿体超微结构与尚熟期相似，但基粒个数及基粒的类囊体数量均较尚熟期少，基粒片层完整，叶绿体中的淀粉颗粒的积累量较尚熟期多，但淀粉颗粒较小。过熟期鲜烟叶叶绿体的超微结构显示叶绿体外膜已不完整，双层膜轮廓模糊，内部基粒结构模糊，基粒个数较成熟期减少，类囊体数量都较适熟期少。

表3 不同处理下K326鲜烟叶组织结构分析

a：尚熟(细胞)；图b：适熟(细胞)；图c：过熟(细胞)；图d：尚熟(叶绿体)；图e：适熟(叶绿体)；图f：过熟(叶绿体)；CW：细胞壁；IS：细胞间隙；Ch：叶绿体；Chm：叶绿体膜；Th：基质类囊体；S：淀粉粒；GL：基粒片层；SL：基质片层a: Yet-maturity (cell); b: Proper maturity (cell); c: Over-maturity (cell); d: Yet-maturity (chloroplast); e: Proper maturity (chloroplast); f: Over-maturity (chloroplast); CW: Cell way; IS: Intercellular space; Ch: Chloroplast; Chm: Chloroplast membrane; Th: Thylakoid; S: Starch grain; GL: Grana lamella; SL: Stroma lamella图1 不同采收成熟度K326鲜烟叶细胞和叶绿体超微结构分析Fig.1 Ultrastructure of fresh leaf cells and chloroplasts of K326 with different harvest maturity

2.5 不同成熟度对初烤烟叶产量和产值的影响

如表4可知，不同成熟度处理下的烤烟品种K326初烤烟叶产值、上等烟比例和均价存在极显著差异(P<0.01)，均以适熟处理下的初烤烟叶产值最高，尚熟叶次之，过熟叶最低。虽然尚熟烟叶平均产量比适熟叶高，但由于等级结构偏低，其平均单价低于适熟叶，所以产值高于尚熟烟叶。

2.6 不同成熟度对初烤烟叶内在化学成分的影响

如表5所示，不同成熟度处理下的烤烟品种K326初烤烟叶总糖、还原糖、淀粉、总氮、烟碱和蛋白质含量存在显著差异(P<0.05)。一般认为优质烟化学成分品质指标糖碱比的比值接近10，总氮与烟碱的比值接近1为最佳。以适熟处理糖碱比和氮碱比指标与优质烟更为接近。

2.7 不同成熟度对初烤烟叶感官评吸质量的影响

从表6可见，从尚熟至成熟，烟叶吃味变醇和，杂气和劲头减小，香气量提高，余味变好，但过熟时烟叶的枯焦杂气明显，感官质量明显变差。不同成熟度K326初烤烟叶的感官质量总分大小为适熟>尚熟>过熟。

3 讨 论

通过试验研究烤烟品种K326不同成熟度处理下鲜烟叶素质差异以及对初烤烟叶产质量和感官质量的影响，得出烟叶产质量和感官质量适熟处理明显优于其他处理，来反推鲜烟叶素质，鲜烟叶素质显著差异指标具体表现在植物学特性、光合特性、化学成分、组织结构和细胞超微结构上。

表4 不同处理下K326初烤烟叶产量和产值分析

表5 不同处理下K326初烤烟叶内在化学成分分析

表6 不同处理下K326初烤烟叶感官评吸质量分析

3.1 影响烤烟产质量的鲜烟叶植物学特性指标

刘伟等[17]研究表明，烟叶的采收成熟度对烟叶的品质有重要影响，能否准确把握烟叶的采收成熟度，将决定采烤烟叶品质的优劣。以鲜烟叶的植物学特性来判断烟叶成熟度是目前最直观和方便的方法，有利于烟农在田间第一时间进入最佳时期进行采收，因此筛选田间烟叶最佳采烤成熟度及烟叶成熟时期植物学形态对提高烟叶产质量具有举足轻重的作用。本研究结果产质量较好的适熟期中部烟叶的颜色：叶色浅黄，叶片落黄80 %，主脉变白60 %，支脉变白40 %；形态方面：叶尖下勾，叶缘下卷，叶表面皱褶，茎叶角度70°；成熟斑达到70 %，茸毛脱落将近50 %，这与王怀珠等[18]研究结果相似。

3.2 影响烤烟产质量的鲜烟叶光合特性和主要化学成分指标

多数理化指标受品种、部位和成熟度的影响均较大。就品种而言，红大的色素明显高于K326，总氮、蛋白质、硝酸还原酶活性和淀粉酶活性K326明显高于红大[19]；就部位而言，色素和硝酸还原酶活性均是随采收部位的上升而不断减小，类胡萝卜素比值、丙二醛、淀粉酶活性、蛋白质和总氮的含量均随采收部位的上升而增加[20-22]。本研究结果产质量较好的适熟期中部烟叶的SPAD值为23.5，总糖含量为14.02 %，还原糖含量为10.63 %，淀粉含量为25.42 %，蛋白质含量为12.02 %。

3.3 影响烤烟产质量的鲜烟叶组织结构和细胞超微结构

鲜烟叶的组织结构受部位和成熟期的影响较大，受烤烟品种的影响较小[23]。徐兴阳等[24]研究表明，烟叶成熟度从尚熟到过熟转变过程中，烟叶的组织结构表现为从紧密到疏松再到紧密的变化趋势。其中叶片厚度、海绵组织厚度、栅栏组织厚度、叶表皮厚度、组织比等指标，随着成熟度增加均呈现“抛物线”变化规律，均表现为具有一个标志性的拐点。本研究结果产质量较好的适熟期中部烟叶的栅栏组织厚度为58.94 μm，海绵组织厚度为68.54 μm，极显著高于尚熟期和过熟期烟叶。

齐虹凌等[25]研究表明，组织结构疏密适当的烟叶，细胞间隙大，利于细胞体内各种化学成分的转化和水分排除，更易形成优质烟叶。不同成熟度烟叶细胞超微结构和组织结构的差异在一定程度上反映了烟叶细胞生理生化反应、内含物降解转化的不同[26]。本研究电镜观察结果烟叶细胞的差异具体表现在叶绿体等细胞器与细胞壁的紧贴程度以及间隙大小上，其中适熟烟叶细胞间隙度较尚熟大，间隙较适度，烟叶更有弹性。另外，还发现适熟期烟叶基粒个数及基粒的类囊体数量均较尚熟期少，基粒片层完整，叶绿体中的淀粉颗粒的积累量较尚熟期多，但淀粉颗粒较小，且叶绿体逐渐由与细胞壁的紧贴状态转变为游离状态。

4 结 论

本研究系统地提出了一套能表征影响烟叶产质量及易烤性的田间鲜烟叶素质指标及参数，其指标包括植物学特性、光合特性、主要化学成分、组织结构以及细胞超微结构。由于烟叶成熟度受多种因素的影响，如品种、部位、生态因素等，因此，对在不同生态因素下不同品种、不同部位烟叶的成熟特征需要专门的研究。