王 充，龙章德，孟丹丹，苏 赞，刘 鸿，邹克兴，许春平*

1. 郑州轻工业学院食品与生物工程学院，郑州高新技术产业开发区科学大道136 号 450002

2. 广西中烟工业有限责任公司技术中心，南宁市北湖南路28 号 530001

以烟梗、烟末和碎烟叶等烟草废弃物为原料，利用造纸法原理加工生产的产品，称造纸法再造烟叶［1-2]。造纸法再造烟叶生产过程中，以水为萃取剂对烟梗、烟末和碎烟叶等原料进行浸提，然后将浸提液经固液分离和高温浓缩后的溶液，称为造纸法再造烟叶浓缩液［3]。对再造烟叶的生产工艺技术的研究，尤其是微生物在再造烟叶生产上的应用是烟草行业的研究热点之一［4-8]。骆莉等［9]利用淀粉酶和糖化酶，以及生香酵母、植物乳杆菌等微生物对烟梗提取液进行改良，结果表明烟梗提取液的香味成分增加，且能够改善卷烟烟气和口感；戴丽君等［10]、周蓉等［11]利用酵母对烟梗萃取液进行发酵处理，处理后的萃取液与未发酵萃取液相比，萃取液香气成分含量提高；张勃等［12]利用从红花大金元品种烟叶表面分离的菌株对烟梗水提物进行发酵处理，处理后烟梗水提物的再造烟叶样品香气丰度与香气量增加、木质杂气减少、细腻性与甜润感改善,抽吸品质有较大提高。因此，利用有益微生物能够提高再造烟叶品质。

目前对烟叶和烟田土壤中的微生物群落已有较多报道［13-14]，对微生物的开发利用大多集中于烟叶或烟田及其他材料中分离得到的菌株，并将其应用于烟叶醇化发酵以改善烟叶品质，对造纸法再造烟叶方面的报道也仅限于烟草萃取液中的细菌群落组成研究［15]，其他真菌群落及相关研究鲜见报道。为此，以造纸法再造烟叶浓缩液为研究对象，应用MiSeq 测序平台对真菌18S rDNA 和细菌16S rDNA 测序，研究浓缩液内微生物真菌和细菌的群落结构，并利用其内部微生物进行发酵，卷制再造烟叶单料烟评价其发酵效果，旨在为有益微生物在造纸法烟草薄片上的应用提供支持。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2016 年8 月在河南卷烟工业烟草薄片有限公司的造纸法再造烟叶生产车间取烟草片基100 g，另取再造烟叶浓缩液500 mL 样品4 个，并将收集的浓缩液样品在无菌条件下混匀为1 个试验样品，于-10 ℃条件下带回实验室，进行发酵试验。

1.2 试验方法

1.2.1 样品基因组DNA 提取

使用Stool Genomic DNA kit 试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司，货号：CW2092S）提取样品基因组DNA。

1.2.2 PCR 扩增和MiSeq 测序

对细菌16S rDNA 的V3～V4 区域进行扩增，扩增片段为470 bp，引物为16s-f：PE1-CCTACGG GNGGWGCAG 和 16Ss-r：PE2-GACTACHVGGG TATCTAATCC（ PE 为测序接头，大小为70 bp）。对真菌18S rDNA 的V4 区域进行扩增，扩增片段为180 bp，引物 为18s-f：PE1-GCGGTAATTCCAG CTCCAA 和18s-r：PE2-AATCCRAGAATTTCACC TCT。PCR 反应体系终体积为25 μL，DNA 聚合酶为KAPA HiFi DNA 聚合酶。16S rDNA 的PCR 扩增反应条件：94 ℃预变性3 min、94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，循环25 次；最后72 ℃延伸10 min。18S rDNA 的PCR 扩增反应条件：94 ℃预变性3 min、94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s、循环25 次；最后72 ℃延伸10 min。PCR 扩增产物使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，目标条带检验合格后，使用MiSeq 测序，测序委托上海祥音生物科技有限公司完成。

1.2.3 测序数据处理与分析

①去除Miseq 测序时加入的引物和接头序列，再根据PE reads 之间的overlap 关系，将成对的reads 拼接成1 条序列，然后按照Barcode 标签序列识别并区分样品得到数据；②使用Usearch 和Uchime 及 数 据 库（RDP 数 据 库 、Silva 数 据 库 和NCBI 16S 数据库）去除非特异性扩增序列和嵌合体，得到有效序列。③根据序列间的相似性在97%水平上将序列分成不同的操作分类单元（Operational taxonomic unit，OTU）聚类，然后在OTU 聚类结果的基础上，选择丰度最高的序列作为OTU 的代表性序列进行各类OTU 分析。 ④从每个OTU 中选择1 条代表序列，使用RDP classifier 2.2 依据GreenGenes 数据库为OTU 序列分配分类单元，并定义分类单元中相对丰度低于0.5%的类别都归为其他种群，相对丰度大于5%的种群定义为优势菌。使用OriginPro9.0 根据分类单元内的种群丰度绘制每个分类单元的饼状图。⑤使用Mothur 1.31.2 软件计算样品的Coverage 和Alpha 多样性指数，包括香农指数（Shannon Index）、ACE 指数、Chao 1 指数、辛普森指数等［16-17]。

1.2.4 浓缩液发酵与化学成分测定

取50 mL 浓缩液于锥形瓶中，放置在摇床内发酵24、48 和72 h，摇床内温度为30 ℃，振荡速率120 r/min。采用标准方法［18]测定还原糖和总糖含量（质量分数）。

1.2.5 再造烟叶样品评吸

取未发酵和发酵24、48 和72 h 后的浓缩液以39%涂布率涂布在烟草片基上，在（40±2）℃的烘箱内烘干后置于相对湿度（65±2）%，温度（22±2）℃恒温恒湿箱中48 h，分别切丝和卷制成单料烟。再将单料烟在温度（22±2）℃，相对湿度（60±5）%的恒温恒湿箱中平衡48 h 后，由广西中烟工业有限责任公司产品室具有评吸资质的技术人员8 人按照标准方法［19]进行评吸。

1.2.6 数据处理

再造烟叶浓缩液的化学指标均重复测定3 次，计算其平均值和标准差。利用SPSS 软件用Duncan新复极差法进行处理间差异显著性的多重比较。

2 结果与分析

2.1 浓缩液微生物的群落结构分析

2.1.1 浓缩液微生物18S rDNA 和16S rDNA 的PCR 产物分析

由图1 可知，16S rDNA 的V3-V4 区域扩增片段 在500 bp 左 右 ，18S rDNA 的V4 区 域 扩 增 片 段在250 bp 左 右 ，18S rDNA 和16S rDNA 的PCR 产物条带清晰明亮，无杂带，扩增片段大小与预设扩增片段大小一致，表明PCR 产物可进行下一步测序分析。

图1 浓缩液微生物的18S rDNA 和16S rDNA 的PCR 产物电泳图Fig.1 Electrophoretogram of 18S rDNA and 16S rDNA PCR products of microorganisms in concentrated liquid

2.1.2 浓缩液微生物测序分析

对造纸法再造烟叶浓缩液内真菌18S rDNA和细菌16S rDNA 的有效序列进行计算得到微生物多样性指数，见表1。由表1 可知，浓缩液内真菌18S rDNA 和细菌16S rDNA 测序的覆盖度均大于95%，说明样品测序结果代表了样本内微生物的真实情况；18S rDNA 的序列数大约是16S rDNA序列数的4 倍，若以序列数代表微生物的数目，造纸法再造烟叶浓缩液内的真菌占总微生物的80.98%，细菌占总微生物的19.02%；造纸法再造烟叶的浓缩液真菌18S rDNA 共形成548 个OTU，细菌16S rDNA 共形成5 295 个OTU，18S rDNA 序列的香农指数、ACE 指数、Chao1 指数明显低于16S rDNA 序列，辛普森指数高于16S rDNA 序列，说明浓缩液内的真菌丰富度和多样性低于细菌。

2.1.3 浓缩液中微生物的门水平多样性分析

利用GraPhlAn 软件，对造纸法再造烟叶的浓缩液真菌产生的548 个OUT，根据每个样本的分类学比对结果选出优势物种，再结合物种丰度信息生成环形树状图，见图2。

表1 造纸法再造烟叶浓缩液微生物多样性指数分析Tab.1 Microbial diversity index analysis of concentrated liquid of paper-making reconstituted tobacco

图2 微生物群落分类与系统发育树状图Fig.2 Classification and phylogenetic tree of microbial communities

图2 中部为丰度前100 个物种进化分类属，并将丰度前20 个物种（以星号标出）所对应的门按不同的颜色标出，分别为A 梭菌属（Clostridium sensu stricto）、B 链球菌属（Streptococcus）、C 酸杆菌属（Lactobacillus）、D 魏 斯 氏 菌 属（Weissella）、E（Enterococcus）、F（Aeribacillus）、G 芽 孢 杆 菌 纲（Bacillus） 、H （Streptophyta） 、I 鲍 特 菌 属（Bordetella）、J（Achromobacter）、K 丛毛单胞菌属（Comamonas）、L 苍白杆菌属（Ochrobactrum）、M 新根瘤菌属（Neorhizobium）、N 根瘤菌（Rhizobium）、O固氮螺菌（Azospirillum）、P 肠杆菌（Enterobacter）、Q大肠杆菌志贺菌（Escherichia/Shigella）、R 黑草属（Buchnera）、S 寡养单胞菌（Stenotrophomonas）、T 不动杆菌属（Acinetobacter）。

由图2 可以看出，样本中微生物分为4 类，蓝藻/叶绿体（Cyanobacteria/Chloroplast）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteob acteria）和未被分类区。以界为中心，向外依次为门、纲、目、科、属和种。圈和星号的大小代表丰度大小。外围环为热力图，每一环为1 个样本（组），每个样本对应1种颜色。颜色深浅随物种丰度而变化，物种丰度越大，颜色越深。

本试验浓缩液中微生物群落结构从门水平上分析，优势菌群为子囊菌门（Ascomycota）、厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）；从属水平上分析，浓缩液中的优势菌群为酿酒酵母属（Kazachstania）、假丝酵母属（Candida）和Ogataea、乳 酸 杆 菌 属 （Lactobacillus） 、链 球 菌 属（Streptococcus）和Aeribacillus。这与赵铭钦等［20]、邱立友等［21]、朱大恒等［22]研究发现的烤烟烟叶表面微生物种群主要是细菌、霉菌和放线菌；而霉菌中曲霉（Aspergillus）为优势菌群的结果不一致，说明烤烟烟叶表面微生物种群的优势菌群（细菌）与再造烟叶浓缩液中优势种群（真菌）差异很大，这可能与再造烟叶浓缩液的生产原料和加工过程，以及浓缩液的理化性质有关。但再造烟叶浓缩液中优势种群是如何影响再造烟叶的香味成分仍有待进一步研究。

2.2 微生物发酵对浓缩液还原糖和总糖含量的影响

微生物发酵过程中，碳源对于微生物生长和代谢产物积累至关重要［23]，因此发酵液中还原糖和总糖含量对浓缩液发酵及再造烟叶的生产有重要影响。由表2 可知，浓缩液发酵前48 h，还原糖和总糖含量缓慢下降；发酵48～72 h 之间，还原糖和总糖含量迅速下降，说明浓缩液中的微生物在发酵48 h 前消耗的碳源很少，生长缓慢，属于迟缓期；48～72 h 之间生长繁殖较旺盛，需要大量的碳源供应，属于生长期和稳定期。

表2 微生物发酵对浓缩液还原糖和总糖含量的影响①Tab.2 Effects of microbial fermentation on contents of reducing sugar and total sugar in concentrated liquid

2.3 微生物发酵对再造烟叶感官品质的影响

由感官评吸结果（表3）可知，发酵时间48 h 和72 h 的浓缩液能够提高再造烟叶的香气量和协调性，提升舒适度。这可能与浓缩液中微生物在48 h至72 h 之间快速生长繁殖，发酵产生一些次级代谢产物，改变了浓缩液中的某些化学成分有关。

表3 再造烟叶评吸结果的比较Tab.3 Sensory evaluation results of reconstituted tobacco

3 结论

造纸法再造烟叶浓缩液微生物的群落结构中主要为真菌种群，含有少量细菌种群。浓缩液中的真菌占总微生物的80.98%，细菌占总微生物的19.02%，浓缩液中的真菌含量高于细菌。真菌种群中的优势菌属为酿酒酵母属（Kazachstania）、假丝酵母属（Candida）和Ogataea；细菌种群优势菌属为乳酸杆菌属（Lactobacillus）、链球菌属（Streptococcus）和Aeribacillus。通过18S rDNA 序列与16S rDNA 序列的Alpha 多样性指数比较，真菌种群的丰富度和多样性低于细菌；利用浓缩液微生物在30 ℃条件下振荡发酵72 h，可明显提高再造烟叶的香气量，改善舒适度。