姜文龙，李千惠，周 婷，江 皓，张往祥

（南京林业大学 林学院 a.南方现代林业协同创新中心；b.扬州小苹果园艺有限公司，江苏 扬州 225200）

高等植物叶片色素组分可分为花青素（Anth）、类胡萝卜素（Car）和叶绿素（Chl），其中花青素显粉色、红色、紫色等，类胡萝卜素显红色、黄色、橙色，叶绿素显绿色[1]，而不同色素间比例关系的变化使植物叶片呈现不同色彩，如鸡爪槭[2]、紫甘蓝[3]、李属彩叶植物[4]等。此为植物叶片呈色的直接原因[5]。

观赏海棠Malusspp.是蔷薇科Rosaceae苹果属Malus落叶小乔木，因其花姿优美，享有“国艳”之美誉而被广泛关注，近年来杂交技术的进步涌现出许多海棠优良观叶品种，然而这些品种尤其是红叶品种，在新叶至成熟叶的生长过程中色彩易发生分化[6]，显著影响了海棠的观叶效果。

传统的植物色素分析方法是将试材经溶液提取后在分光光度计上进行测定分析，该方法费时费力，且对试材破坏性较大。无损伤光学测定法的出现弥补了溶液提取法的短板，该方法利用叶片对光的反射与吸收原理，将反射波段数值代入公式计算得到色素相对含量，并与溶液提取方法所得的绝对含量进行函数拟合，具有快捷高效的优点，适合大样本背景下的数据处理[7-8]，目前国际上常用的光谱分析仪有Unispec光谱分析仪和MSR-16多光谱辐射仪[9]，其中Unispec光谱分析仪广泛应用于植物色素的观测[10-12]。本研究将溶液提取法与Unispec光谱分析仪相结合，对57个观赏海棠品种的叶片进行色素含量动态测定，分析了叶片从新叶至成熟叶生长过程中色素变化特征以及动态规律，为海棠优良观叶种质的筛选以及叶色改良提供理论参考。

1 材料和方法

试验地位于江苏省扬州市仙女镇（119°55′E，32°42′ N），属北亚热带季风气候区，年降水量1 000 mm，年均温14.9 ℃，无霜期约为320 d，地势平坦。试验地土壤质地为沙壤土，深厚肥沃。57份观赏海棠种质为1年生嫁接苗，其砧木采用1年生湖北海棠，嫁接时间为2015年9月，具体品种见表1。

色素相对含量测定：2016年5月于晴天的7:00—8:00进行样本采集，供试品种按上位叶（Upper leaf）、中位叶（Middle leaf）、下位叶（Lower leaf），分别从新梢部位、苗干中部和苗干下部各采集5枚叶片。采用Unispec-SC 光谱分析仪（美国，PP Systems）进行花青素（Anth）、类胡萝卜素（Car）和叶绿素（Chl）的相对含量测定，每枚叶片选择不同的6个点进行观测，每个品种的重复次数为30次，最后代入公式计算。公式为花青素（Anth）：R800（1/R550-1/R700）；类胡萝卜素（Car）：R800（1/R520-1/R700）；叶绿素（Chl）：（R750-R445）/（R705-R445）[13-14]。

色素绝对含量的测定及拟合函数的构建：于5月按叶片色彩由浅至深的原则，选取M.‘Eleyi’、M.mandshurica、M.‘Thunder Child’、M.‘Roudph’、M.‘Show Time’的上位叶；M.‘Addirondack’、M.‘Weeping Madonna’ 的下位叶等7个具有代表性的品种，每个品种各采集20枚叶片。首先利用Unispec-SC 光谱分析仪对Anth、Car、Chl进行反射光谱值的测定，之后将每个品种的叶片分为3组，进行色素绝对含量的测定。其中花青素的测定方法采用2%盐酸甲醇溶液浸提法[15-16]；叶绿素和类胡萝卜素采用丙酮乙醇等量混合溶液浸提法[17]。最后分别拟合3大色素所对应的方程，并计算57个海棠品种不同叶位的色素实际含量。

数据处理：函数的拟合采用Excel 2010进行，色素组分的三维动态图采用Origin 9.0进行，聚类分析图采用SPSS 19.0和MEGA 4.0进行绘制。3大色素权重计算方法为：色素/3种色素总量；色系分类采用RHS比色卡法。

2 结果与分析

2.1 叶片色素绝对含量与相对含量的拟合函数

选取具有一定色彩梯度的7个品种参与方程的拟合（见表2）。其中垂枝麦当娜的花青素绝对含量和类胡萝卜绝对含量均为最低，而叶绿素绝对含量为最高。花青素绝对含量最高的为时光秀，类胡萝卜素绝对含量最高的是宝贝，叶绿素绝对含量最低的是鲁道夫。

表3、图1是基于7个不同色素梯度的代表性品种建立的叶片色素绝对含量（y）与相对含量（x）间的函数关系式，分别为：花青素yAnth=0.522 1x2- 0.111 4x+0.013 3（R2=0.979 3）；类胡萝卜素yCar=0.456 2x+0.072 6（R2=0.980 9）；叶绿素yChl=1.428 7x-0.672 6（R2=0.901 6）。3种色素拟合效果较好，适用于57个海棠种质的色素实际含量计算。

表2 花青素、类胡萝卜素、叶绿素绝对含量和相对含量Table2 Absolute and relative contents of Anthocyanin, Carotenoid and Chlorophyll

表3 海棠叶片色素绝对含量与相对含量的拟合函数Table3 Fitting functions between absolute and relative contents of pigments in leaves of Begonia crabapple

2.2 不同叶位叶片色素含量的空间变化格局

基于57份观赏海棠种质的上、中、下位叶的色素含量（Anth、Car、Chl）分别绘制了不同叶位色素组分含量与权重的空间变化图（图2）。

图1 3种色素绝对含量与相对含量的拟合函数Fig.1 Fitting function of absolute and relative contents of three pigments

图2 观赏海棠不同叶位色素组分含量与权重空间变化Fig.2 Spatial variations of pigment content and weight in different leaf positions of ornamental crabapple cultivars sea otters

在Anth、Car维度方面，随着叶位的降低，57个海棠种质的色素位点呈现出整体左移（减小）的趋势。Anth的权重（上位叶0.311% ～7.483%→中位叶0.277% ～ 3.332%→下位叶0.199% ～ 0.983%）与Car的权重（上位叶8.782% ～19.995%→中位叶6.464% ～ 13.557%→下位叶5.138% ～ 11.079%）相比下降幅度较大。

在Chl维度方面，随着叶位的降低，海棠种质的色素位点呈现出整体上移（增大）的趋势，权重变化为：上位叶74.287% ～ 90.738%→中位叶 83.742% ～ 92.821% →下位叶 88.225% ～94.649%。

叶绿素在3大色素中所占比重最高，而花青素与类胡萝卜素的比重呈较低水平。由此可见，叶绿素奠定了海棠叶片色彩的基调，花青素与类胡萝卜素含量的高低使叶片呈现出不同的色彩。

2.3 基于观赏海棠色素组分聚类分析

花青素含量的高低影响着叶片呈色，上位叶中花青素含量最高，因此基于上位叶叶绿素含量、花青素含量及权重数据进行聚类分析（图3）。将叶片色彩与英国皇家园林比色卡比对后，结果表明：57份海棠种质可分为绿色系（含深绿色系、褐绿色系）和红色系含（紫红色系、红棕色系），各色系差异显著（表4）。

图3 基于上位叶色素组分含量和权重的聚类Fig.3 Clustering analysis tree diagram based on pigment component content and proportion in leaf positionsat upper leaf

表4 基于聚类分析的海棠品种色素参数统计与分析†Table4 Statistical analysis on parameters of ornamental crabapple’s leaf pigment based on clustering analysis

绿色系 A：随着叶位的降低，花青素、类胡萝卜素含量始终保持较低水平，而叶绿素含量稳步增高（图4），花青素/叶绿素为0.006 ± 0.003，因此叶片呈现绿色。该色系共28个品种，包含A1和A2两个子类。

深绿色系A1（Green group）： 从上位叶至下位叶，花青素、类胡萝卜素含量变化平稳（差异不显著），叶绿素含量分别增加了27%、75%，同时花青素与叶绿素之比达到全部色系最低，为0.004（图4）。该色系共有18个品种，包括：M.‘David’、M.‘Donald Wyman’、M.‘Snowdrift’、M.‘Golden Raindrop’、M.‘Sugar Tyme’、M.‘Spring Snow’、M.‘Gorgeous’、M.‘Sweet Sugartyme’、M.‘Calocarpa’、M.‘Addirondack’、M.‘ Winter Red’ 、M.‘ G u a r d’ 、M.‘Everest’、M.‘Louisa’、M.‘Molten Lava’、M.‘Weeping Madonna’、M.‘Louisa Contort’、Xuanwu。

褐绿色系 A2（Yellow green group）：在上位叶中，花青素含量为绿色系最高（0.013 ±0.005）mg·g-1，较A1增加了51%，到中位叶阶段淡化，与下位叶保持相同水平（图4）。该色系共10个品种，包括：M.floribunda、Changhong、M.kirghisorum、M.‘Eleyi’、M.‘Professor Sprenger’、M.‘Hydrangea’、Nanjing Sanye、M.‘Mary Potter’、M.‘Ballet’、M.spectabilis。

红色系（B）：上位叶具备一定量的花青素使该系呈现红色（0.074 ± 0.027）mg·g-1，但随后逐步下降，与上位叶相比，在中位叶和下位叶分别下降了50%、84%（图4）。该色系共有29个品种，包含B1和B2两个子类。

紫红色系 B1（Purple group）：在上位叶中花青素含量以及花青素与叶绿素含量之比均为全部色系最高，其中花青素含量(0.078±0.025) mg·g-1是B2色系的2.1倍，花青素与叶绿素含量之比为0.04±0.013（图4），因此该系呈色最红。与上位叶相比，中位叶和下位叶分别下降了50%、85%，与红色系整体变化基本相同。该色系共26个品种，包括：M.‘Centurion’、M.‘R e d B a r o n’、M.‘M a k a m i k’、M.‘Pink Spires’、M.‘Lisa’、M.‘Royal Raindrop’、M.‘Candy Mint’、M.‘Selkirk’、M.‘Purple Gems’、M.‘Purple Prince’、M.‘Brandy Wine’、M.‘Robinson’、M.‘Pink Princess’、M.‘Royalty’、M.‘Indian Summer’、M.‘Superstar’、M.‘Roudph’、M.‘Radiant’、M.‘Show Time’、M.‘Diamond’、M.‘Cardinal’、M.‘Coccinella’、M.‘Almey’、M.‘Adams’、M.‘Perfect Purple’、M.‘Thunder Child’。

图4 不同色系类群的色素组分含量动态格局Fig.4 Dynamic pattern of pigment component content in leaves of different color series and subseries groups in different leaf positions

红棕色系 B2（Red purple group）：上位叶的花青素含量较B1下降了53%（图4），呈色不如B1醒目。该色系共3个品种，包括：M.‘Strawberry Jelly’、M.hupehensis、M.mandshurica。

3 结论与讨论

3.1 观赏海棠叶片色素含量与叶色关系讨论

色素降解是植物叶片生长过程中较为普遍的现象，例如红宝石海棠[18]、红花檵木[19]、紫叶李[20]、金叶榆[21]等。

传统海棠观叶品种局限于原种，包括垂丝海棠M.halliana、西府海棠M.micromalus、湖北海棠M.hupehensis等，这些品种如湖北海棠，在本研究中属B2红棕色系，该系虽显红色但色彩不够艳丽，同时在叶片生长过程中色素淡化较为严重，从上位叶至中位叶花青素含量减少了58.4%，与下位叶花青素含量 [（0.012±0.005）mg·g-1]几乎持平（差异不显著），因此呈色效果较差。近年来杂交技术的进步丰富并提高了海棠叶色的多样性和稳定性，本研究中红色系之紫红色系（B1）品种皆为杂交种，该色系的花青素含量与B2相比不仅增加了53%，而且从上位叶至中位叶，花青素含量均值分别是B2子色系的2.1倍和2.6倍。此外，该色系在中位叶阶段的花青素含量[（0.039±0.112）mg·g-1]虽较上位叶下降了50%，但仍然达到了B2色系在上位叶阶段的含量水平[（0.037±0.017）mg·g-1]，因此该系叶色不仅“红艳”，且呈色较为稳定。

植物叶片中色素含量及其比例关系是叶色变化的主要原因之一，陈延惠等[22]在对园艺植物叶色变化机制的研究中指出叶色变化与花青素/叶绿素总量呈正相关关系，与叶绿素总量呈负相关关系。L*（亮度值）、C*（饱和度）、h°（色调角）是色彩三属性[23]，其中h°能够直观地看出色彩的变化。根据姜文龙等[6]对观赏海棠叶色的研究，紫红色系的色调角（h°=33.98±10.29）较低位于深红区域，具有“正红”特性，在本研究中该色系（B1）的花青素含量以及花青素与叶绿素含量的比值均达到了全部色系最高，分别为0.078±0.025 mg·g-1、0.04±0.013，这为紫红色系海棠品种的“正红”特性提供了生理学解释。由此可见，杂交育种对于观赏海棠叶色的改良主要通过增加花青素含量，降低色调角来实现的。

3.2 观赏海棠叶色稳定性的保持及改良策略

花青素常与不同类型的糖苷相结合，以花色苷的形式存在于植物中的类黄酮化合物，是植物花、叶、果呈色的重要物质之一[24]。花青素的合成与降解因素可分为外因和内因，内因包括结构基因和转录因子的调控[25-26]，外因包括光照[27]、温度[28-29]、水分[30]、施肥元素配比[31]等。

近年来对于观赏海棠叶片花青素的调控多集中于内外环境因子诱导方面。高燕[32]采用低氮胁迫处理海棠花Malus spectabilis离体叶片，发现随着氮浓度的降低，离体叶片中的花青苷含量呈增加趋势。低温可以促进CHS基因的表达，使植物叶片花青素含量上升而叶绿素含量下降[33]，例如红宝石海棠[18]、春雪海棠、王族海棠[34]。在本研究中，绿色系之褐绿色系（A2）在上位叶阶段虽含有一定量的花青素，但不足以使叶片呈现出“全红”状态，因此绿色表达效果不如A1子色系，对于该系的改良应减少花青素，使叶片呈现出“纯绿”状态；红色系之紫红色系（B1）在上位叶阶段具有最多的花青素，中位叶阶段虽有所淡化，但其含量仍达到了B2子色系在上位叶阶段的水平，具有较大的改良潜力。该系在成熟叶阶段色素淡化较为严重，其含量较新叶（上位叶）已下降了85%，因此对于紫红色系的改良应通过低氮胁迫、低温诱导、调节光照等方法来减缓叶片生长过程中色素的淡化，使整株叶片达到“全红”效果。

本研究以57个观赏海棠品种的叶片色素为基础，研究了不同叶位阶段3大色素（Anth、Car、Chl）含量的动态变化，为观赏海棠叶片呈色提供理论依据。但本研究仅从宏观角度对色彩与色素的关系进行探讨，未深入研究色素的形成机制，以及各色素间含量变化对于叶片呈色的影响。因此在今后的研究中，应从基因、分子等微观角度切入，对呈色机制作详细探讨，这对于观赏海棠叶色育种及良种选育将有十分重要的意义。