南极磷虾蛋白粉的制备工艺

2019-04-04王凌云邓尚贵李钰金霍健聪谢卓宣徐燕娟

食品与发酵工业 2019年6期

王凌云，邓尚贵*，李钰金，霍健聪，谢卓宣，徐燕娟

1(浙江海洋大学食品与药学学院，浙江舟山，316000)2(山东泰祥食品股份有限公司，山东荣成，264300)

南极磷虾(Euphausiasuperba)属甲壳纲，为一种生活在南大洋海域的高等浮游甲壳动物。南极磷虾营养价值高，但由于南极磷虾体内自溶酶活性高，捕捞后极易自溶，鲜销时需要完善的冷链保存。因此，开发南极磷虾蛋白资源的新的利用途径成为当务之急。

蛋白粉是目前深受消费者欢迎的营养保健品，南极磷虾蛋白质含量高，脂肪含量低，且富含多种矿物质，属优质动物蛋白资源，是生产蛋白粉的优质原料。目前，国内南极磷虾蛋白的加工和利用研究刚刚起步[1-4]，关于南极磷虾蛋白粉的研究报道基本处于一片空白。本研究小组采用木瓜蛋白酶对南极磷虾进行酶解，制备南极磷虾蛋白液，利用喷雾干燥制备南极磷虾蛋白粉，并对蛋白粉进行营养评价，为这类资源的高值化开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

南极磷虾(于2018年1日捕获)，山东泰祥食品有限公司提供。冷冻南极磷虾于2018年3月6日在冷冻条件下运至实验室，于-60 ℃条件下贮存。

木瓜蛋白酶(2×105U/g)，购于广西南宁庞博生物工程有限公司；化学试剂及分子质量标准品等均购于国药集团上海化学试剂有限公司(分析纯)。

液相色谱仪(安捷伦 1260)，美国安捷伦科技公司；氨基酸自动分析仪(L-8900)，天美科学仪器有限公司；原子吸收分光光度计(TAS-990)，北京普析通用仪器有限责任公司；色差仪(WF32)，上海化科实验器材有限公司；紫外可见分光光度计(UV-2600)，上海皖宁精密科学仪器有限公司；喷雾干燥机(SD-1000)，日本东京理化；旋转蒸发仪(A-1000S)，日本东京理化；其余均为实验室常用设备。

1.2 实验方法

1.2.1 实验流程

冷冻南极磷虾→解冻→称量→加水匀浆→恒温酶解→灭酶(100 ℃，15 min)→

1.2.2 酶解条件单因素试验[5]

南极磷虾原料，南极磷虾于实验前一日从超低温冰箱中取出，置于普通冰箱冷藏室内自然解冻，实验前用滤纸吸干表面水分，采用食物搅拌机搅碎后制得南极磷虾肉糜。南极磷虾酶解用酶，考虑到木瓜蛋白酶资源丰富，价格低廉，且水解能力好等优点，本实验选择木瓜蛋白酶进行水解。取经搅碎后的南极磷虾肉糜15 g置于烧杯中，加入适量蒸馏水，调节pH值，加入适当比例的木瓜蛋白酶，用水浴锅升至合适温度，并在此温度下保温酶解。酶解结束后升至100 ℃，保温15 min后灭酶，离心取上清液，进行超滤分离，测定蛋白酶水解度。具体酶解条件如下。

料液比：在加酶量为3 000 U/g，酶解温度55 ℃， pH 6.5时，设料液比分别为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，在此条件下恒温水浴2 h。

加酶量：在酶解温度55 ℃，pH 6.5，料液比为1∶2 时，设加酶量分别为600、1 800、3 000、4 200、5 400 U/g，在此条件下恒温水浴2 h。

温度：在加酶量为3 000 U/g，pH 6.5时，料液比为1∶2时，设水浴加热温度分别为45、50、55、60、65 ℃。在此条件下恒温水浴2 h。

pH值：在加酶量为3 000 U/g，酶解温度55 ℃，料液比为1∶2时，设pH值分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，在此条件下恒温水浴2 h。

酶解时间：在加酶量为3 000 U/g，酶解温度55 ℃，料液比为1∶2时，pH值6.5时，设水浴加热时间分别为0.5、1、2、4、6 h。

1.2.3 南极磷虾水解度的测定[6]

待南极磷虾酶解结束，将酶解液离心，取上清液并进行超滤，得到酶解液。用甲醛滴法测定上清液氨基酸含量，代入式(1)计算水解度(DH)。

(1)

1.2.4 酶解物分子质量排布测定

酶解物分子质量排布测定采用凝胶过滤色谱法。称取一定量南极磷虾酶解物用流动相溶解，在0.45 μm膜过滤后上柱记录出峰时间，求其相对分子质量[7]。层析条件:色谱柱(TSK gel 2500 PWXL 300 mm×7.8 mm)，柱温40 ℃，流速0.5 mL/min，在波长220 nm下测定。

1.2.5 南极磷虾蛋白粉喷雾干燥工艺[8]

首先将南极磷虾酶解液在真空浓度为0.95 MPa，转速5 000 r/min条件下进行真空浓缩。浓缩结束后的酶解液喷雾干燥，每次干燥处理料液量1 500 mL。

进料浓度：进风温度180 ℃，进料温度30 ℃，进料速度12 mL/min，出风温度80 ℃条件下，分别选用进料液蛋白质量浓度为100、150、200、250 g/L的料液喷雾干燥。

进风温度：在进料液蛋白质量浓度为250 g/L，进料温度30 ℃，进料速度12 mL/min，出风温度80 ℃条件下，分别选用160，170，180，190和200 ℃作为进风温度。

进料速度：选用进风温度180 ℃，进料液蛋白质量浓度250 g/L，进料温度30 ℃，出风温度80 ℃条件下，进料速度分别采用6，8，10，12和14 mL/min。

进料温度：选用进风温度180 ℃，进料液蛋白质量浓度250 g/L，进料速度12 mL/min，出风温度80 ℃，选取进料温度分别30，40，50和60 ℃。

1.2.6 堆积密度及溶解度的测定

堆积密度测定[9]：将蛋白粉从漏斗中撒落至干燥的10 mL量筒(量筒质量记为m1)中，测定量筒和蛋白粉总质量(记为m2)，则堆积密度按式(2)计算。

(2)

溶解度测定参照GB5413.29—2010《婴幼儿食品和乳品溶解性的测定》。

1.2.7 蛋白粉白度、湿润性、分散性及流动性的测定

蛋白粉白度测定采用色差仪[10]；湿润性、分散性及流动性测定参照王一等[11]的方法。

1.2.8 南极磷虾蛋白粉营养成分分析

南极磷虾蛋白粉蛋白质、脂肪等基本营养成分测定等参照李明杰的方法[12]。

1.2.9 数据分析

采用SPSS 17.0 软件中线性回归(linear regression)、单因素方差分析(one-way ANOVA)、多因素方差分析(univariate)进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 南极磷虾蛋白酶解工艺

图1～图5分别是加酶量、酶解温度、pH值、酶解时间和料液比对水解度的影响。由图1可知，酶用量越高，水解度越高，当酶用量为1 800～3 000 U/g蛋白时，水解度上升显著。当酶用量继续增加，水解度增加缓慢，差异不显著。当酶用量为3 000～4 200 U/g时，水解度增幅逐渐减小，趋于平衡。故酶用量确定为3 000 U/g。酶解温度对水解度的影响见图2，为明显的峰状曲线。当温度为55 ℃时水解度最高，且与其他温度条件存在显著性差异，表明55 ℃为最适酶解温度。pH对蛋白回收率的影响同温度相似，同样呈较为典型的峰状曲线，当pH 6.5时水解度最高，且与其他pH值存在显著差异，所以pH对酶解反应影响很大[13]。

图1 加酶量对水解度的影响Fig.1 Influence of enzyme content on hydrolysis degree

由图4可知，酶解时间越长，水解度越高，而酶解时间达2 h后，水解度差异不显著。图5表明随着料液比增加，水解度呈逐渐下降趋势。虽然当料液比为1∶1时，水解过程中会出现酶解不充分的现象。而当料液比为1∶2时，下降不多，且经实验验证，此时酶解反应比较充分。因此选择料液比1∶2 作为酶解反应的浓度。实践表明，食品蛋白的酶解改性具有安全可靠、作用温和、专一性强、效率较高的特点[14-16]。

图2 温度对水解度的影响Fig.2 Influence of temperature on hydrolysis degree

图3 pH对水解度的影响Fig.3 Influence of pH on hydrolysis degree

图4 酶解时间对水解度的影响Fig.4 Influence of time on hydrolysis degree

图5 料液比对水解度的影响Fig.5 Influence of the material solution to hydrolysis degree

单因素试验结果表明：酶用量3 000 U/g蛋白、酶解温度55 ℃、pH 6.5、酶解时间2 h和料液比1∶2为最佳酶解条件。

2.2 南极磷虾酶解产物分子质量排布

按照木瓜蛋白酶用量3 000 U/g蛋白、55 ℃、pH 6.5、酶解时间2 h、料液比1∶2的工艺条件酶解南极磷虾，所得酶解液的相对分子质量见图6。首先，根据标准蛋白质相对分子质量及其对应的出峰时间，求出相对分子质量标准曲线，再用南极磷虾酶解物上柱，记录出峰时间，从标准曲线即可求出南极磷虾酶解产物的相对分子质量。由图6可以看出南极磷虾酶解液的分子质量多集中在3～10 kDa。通过前述实验条件制备的南极磷虾酶解产物中相对分子质量大多处于3～10 kDa，表明该水解条件较为理想。

图6 南极磷虾酶解产物分子质量排布Fig.6 Molecular weight distribution of Euphausia superba enzymolysis products

2.3 喷雾干燥工艺对南极磷虾蛋白粉品质的影响

2.3.1 进料浓度对蛋白粉品质的影响

表1列出不同进料量对南极磷虾蛋白粉的影响。进料浓度很大程度上影响喷雾干燥的效果，还影响着喷雾干燥生产的经济成本。由表1可以看出，物料的进料浓度越大，蛋白粉水分含量越低。而蛋白粉的白度随着进料浓度的加大而有所降低，白度的测定采用申光WSC-S测色色差计测量，这是因为当浓度达到一定数值时，液滴表面水分蒸发速度快，表层容易形成固壳，使得粉粒内部残留部分水分，造成白度有所降低[17]。

当进料液蛋白质量浓度较高(200 g/L，250 g/L)时，蛋白粉的堆积密度比进料液蛋白质量浓度较低(100 g/L，150 g/L)时要高。这可能是由于进料浓度增大导致了料液在经雾化后的产品水分含量降低，更为干燥，因此堆积密度增大。而流动性和分散性则随着进料浓度的升高有所降低。总体而言，进料浓度对白度、堆积密度等品质指标影响并不显著。因此，应从干燥后水分含量低的高浓度进料浓度考虑。但当用大于250 g/L的进料浓度进行喷雾干燥时，料液变得过于黏稠。尽管采用磁力搅拌器搅拌，但雾化效果极差，雾化喷头处极易出现油状黏稠液滴。虽然所得蛋白粉水分含量及分散性的指标好，但从实际出发，选择进料液蛋白浓度25%较为适宜。

表1 不同进料液蛋白质量浓度对南极磷虾蛋白粉品质的影响Table 1 Effect of liquid concentration on protein powder quality

注：进风温度180 ℃，进料温度30 ℃，进料速度12 mL/min；同列不同字母表示在0.05水平上差异显著。

2.3.2 进风温度对蛋白质品质的影响

表2给出了进风温度对南极磷虾蛋白粉品质影响。由表2可以看出，干燥后的蛋白粉水分含量和进风温度成反比。堆积密度测定方法为：用漏斗向量筒中均匀地撒落样品，撒满后称量样品的质量,计算堆积密度[18]。当进风温度较低(160 ℃，170 ℃)，蛋白粉的白度，堆积密度，流动性和湿润性等无明显差异。此时由于含水量较高，喷雾干燥所得蛋白粉黏度较高，因此无法测量分散性。总体而言，进风温度越高，蛋白粉品质有所升高，但当进风温度超过190 ℃后，部分蛋白粉发生了高温变性，导致蛋白粉附着于喷雾干燥管壁，以至于得率降低。最终确定喷雾干燥进风温度为180 ℃。

表2 进温度对南极磷虾蛋白粉品质的影响Table 2 Effect of feeding temperature on protein powder quality

注：进料温度30 ℃、进料速度12 mL/min，进料液蛋白质量浓度25%，“-”表示未能检测，下同。同列不同字母表示在P=0.05水平上差异显著。

2.3.3 进料速度对蛋白质品质的影响

表3列出进料速度对南极磷虾蛋白粉品质的影响。从表可以看出，蛋白粉的水分和白度随着进料速度的增加而上升。这是由于物料经喷雾系统处理后变为小液滴，进料量越大，在造雾压力一定的情况下，料液被雾化成雾滴的粒径越大，由于惯性作用其速度也越大，其在干燥器内停留时间短，容易发生干燥不完全的现象，从而导致终产品含水率较高[19]。而进料速度和蛋白粉堆积密度成反比。

表3 进料速度对南极磷虾蛋白粉品质的影响Table 3 Effect of feeding speed on protein powder quality

注：进风温度180 ℃，进料浓度250 g/L，进料温度30 ℃。同列不同字母表示在P=0.05水平上差异显著。

这可能由于进料速度加大后，雾化的小液滴量增加，在热空气量恒定的条件下，单位质量小液滴吸收热量降低，导致干燥颗粒含水量增加，相互黏结趋势增大，产生较大的堆积体积，堆积密度降低[20]。当进料速度为6 mL/min和8 mL/min时，流动性和分散性间差异不显著(P>0.05)。当进料速度增大，流动性变化较大，然而进料速度大于12 mL/min后，水分含量过高，蛋白粉分散性变差。此外，不同进料速度组蛋白粉白度无显著性差异。综合考虑后确定进料速度保持在12 mL/min较为适宜。

2.3.4 进料温度对蛋白粉品质的影响

表4为进料温度对南极磷虾蛋白粉的影响。由表4可知，随着进料温度的升高，水分含量下降，堆积密度上升，而分散性、流动性变好，进料温度对白度影响不明显。这可能是因为进料温度升高后加快喷雾液滴的干燥，提高干燥效率，干燥更为彻底。由表4可知，进料温度30 ℃和60 ℃的物料干燥后所得产物水分含量均低于5%，达到GB 11674—2010《食品安全国家标准乳清粉和乳清蛋白粉》要求。从生产实际出发，选择30 ℃更为方便，确定30 ℃为进料温度。

按各单因素试验确定的最佳工艺参数进行组合试验后，得到的蛋白粉品质如表5所示。蛋白粉外观呈白色粉状，颗粒较细，吸湿性较强。