田小芳

（海南大学热带农林学院 海南海口 570228）

竹柏［Podocarpus nagi （Thun.）Zol.let.Mor.］，为罗汉松科竹柏属常绿乔木，别名糖鸡子、罗汉柴、椰树、山杉、铁甲树等，属裸子植物类。广泛分布于浙江、福建、江西、湖南、广东、广西、海南和四川等地［1］。

竹柏在我国南方有大量栽培，但多作为观赏的园庭、园林树种，在医药上的研究应用并不多见［1］。据报道，竹柏的根、茎、叶以及种子含有多种化学成分，仅从竹柏叶的精油中就分离出37种化学成分。竹柏中的二萜类化合物具有很强的抗氧化活性，能抑制Fe（III）-ADP/NADPH 引起的微粒脂质体氧化和线粒体过氧化，以及亚油酸的自动氧化等作用。竹柏中的竹柏内酯A、B 具有极强的细胞毒性作用，有治疗肿瘤的功效。竹柏内酯C、D、F对真菌有抑制作用［2］。可见，竹柏有较好的研究和开发前景。

植物内生菌（Plant Endophyte）是指那些在生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的微生物，被感染的宿主植物（至少暂时）不表现出外在病症。可从经过严格表面消毒的植物组织或植物组织内部分离得到［3］。

植物内生菌的种类、分布、定植都因植物种类不同而异，包括内生真菌、内生细菌和内生放线菌，目前研究的植物已达上百种［4］。尽管内生菌在植物体中的生物量微不足道，但现有研究已发现，内生菌对宿主植物至少有以下几方面的作用：固氮、促进植物生长、抗逆境、抗动物摄食、抗病原菌以及他感等［5］。在植物体内有稳定的生存空间，一旦进入植物体内，即可独立繁殖和传递，并占据有利的生态位点来防止病原菌的入侵。植物内生菌（Plant Endophyte）一词于1866 年由DeBary 提出，之后在1993 年美国蒙大拿州立大学的Stierle 等从短叶红豆杉（Taxus Nutt）的韧皮部中分离到一株产抗癌物质紫杉醇（Taxol）的内生真菌（Taxomyces andreanae），掀起了药用植物内生菌的研究热潮［6］。

因此，通过传统的表面消毒的方法对竹柏叶进行内生菌的分离，采用对峙培养及对峙划线法获得菌株进行皿内拮抗活性筛选，对高拮抗菌株进行16sRrDNA 的扩增，为内生菌的研发寻找新型菌落代谢产物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物采集

竹柏采自于海南大学儋州校区。

1.1.2 供试植物病原指示菌

灰斑病菌、棒孢病菌、西瓜枯萎病菌、芒果炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、香蕉炭疽病菌、芒果蒂腐病菌、水稻纹枯病菌。

1.1.3 供试培养基

细菌（LB）培养基： 1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母膏，蒸馏水100 mL，121℃蒸汽灭菌20 min。真菌（CM）培养基：1%蛋白胨，1%酵母膏，2%蔗糖（葡萄糖），1.5%～2%琼脂，蒸馏水100 mL，加抗生素链霉素（不能高温灭菌）100 μg/ mL。PDA 培养基：马铃薯200 g，葡萄糖（蔗糖）20 g，琼脂20 g，水1 000 mL，pH 7.0。

1.1.4 实验仪器

超净工作台、全自动高压湿热灭菌锅、电子天平、研钵、电磁炉、电热恒温鼓风干燥箱、紫外仪、离心机、PCR扩增仪。

1.1.5 实验试剂

无菌水、酒精、0.1% HgCl2、TAE、试剂盒OMEGA D3350-01Bacterial DNA Kit（50）。

1.2 方法

1.2.1 竹柏内生菌的分离、筛选及保种

1.2.1.1 竹柏内生菌的分离培养

将采集来的新鲜植物的叶片在自来水下冲洗，洗去表面的泥和灰尘，室内晾干后进行常规组织表面消毒。表面消毒处理：在无菌的条件下操作，将少许叶片放入含有70%乙醇的烧杯中浸泡1 min，之后用灭菌过的镊子将叶片夹出用无菌水淋洗2～3 次，再将叶片放入含有0.1%的HgCl2中，浸泡1 min，取出用无菌水洗4～5 次，洗好之后用灭菌过的剪刀剪小放入灭菌好的研钵中，并向其中加入5 mL 的无菌水充分研磨制成组织悬浮液，之后用移液枪吸取200 μL 的上清液涂布在灭菌过的LB 培养基和加有链霉素抑制细菌的CM 培养基中，并在每个培养皿中倒入4～5个灭菌过的玻璃珠前后摇晃将其上清液均匀的涂布在平板中，用封口膜封好平板，将以上平板放入28℃的培养箱中培养2～7 d。

试验设一个空白对照，将表面消毒最后一次无菌水涂抹于供试的LB 培养基和CM 培养基上，同样的培养条件和时间，观察是否有菌长出。如果空白对照中有菌长出，则试验视为失败，重新分离。

1.2.1.2 拮抗细菌的筛选

从保种管中接出内生细菌进行平板划线扩大培养以备用，同时也从试管斜面中接出病原菌（靶标菌）放入PDA培养基中扩大培养以备用。

为了测定内生菌对病原菌的抑制活性，采用对峙培养法对分离得到的内生细菌进行拮抗活性筛选，用灭菌过的打孔器打取培养好的病原菌放于配制好及灭菌过的PDA培养基平板中央，用接种环挑取纯化好的内生菌种划在距平板中央左右对称的两侧，封好平板将其放在28℃的培养箱中培养2～7 d，观察抑菌的长势和形状，一个供试植物病原指示菌设2个重复。选出对病原菌生长有抑制作用的菌株。

1.2.1.3 拮抗内生细菌的保种

在空白对照没长出菌的情况下，对内生菌进行分离与筛选，采用多次划线法挑单菌落接种到液体培养基中，放入28℃的摇床培养24 h。准备好灭过菌的40%甘油，取700 μL 甘油和700 μL 菌液先后加入1.5 mL 的保种管中，放入-20℃冰箱中保存，备用。

1.2.2 对DYSL5和LR5 16SrDNA的扩增

1.2.2.1 拮抗菌的活化

将具有高抗性的内生细菌从保菌管中接种到LB 培养基上，采用三线划线法分离得到单菌落，用接种环将单菌落接种到试管液体培养基中，放到28℃的摇床中过夜培养。

1.2.2.2 拮抗菌DNA的提取

基因组DNA 提取采用的试剂盒为OMEGA D3350-01Bacterial DNA Kit（50），其方法如下：

从摇床中取出培养好的LB液体拮抗菌株悬浮液，倒入1.5 mL 的微型管中，收集不超过3 mL 的菌液，放入离心机4 000×g，室温下离心10 min。倒掉上清液加入180 μL 的ddH2O ，再加20 μL，50 mg/mL lysozyme solution，充分混匀后，放入水温为30℃的水浴锅10 min。取出后放入离心机5 000×g，在室温下离心5 min。倒掉上清液加入200 μL Buffer BTL，充分混匀。加入25 μL Proteinase K solution ，充分混合后，放入水温为55℃的水浴锅水浴不超过1 h，并且每20 min 摇晃一下。水浴完成后加入220 μL Buffer BDL，混匀，65℃水浴10 min。加入220 μL 无水乙醇，轻晃20 s。将DNA迷你管放入收集管中，再将1.5 mL 微型管中的液体用枪头移入DNA迷你管中。放入离心机10 000×g，在室温下离心1 min。倒掉收集管中的液体，再往DNA 迷你管中加入500 μL Buffer HB，离心10 000×g，1 min，倒掉收集管中的液体。往DNA迷你管中加入700 μL DNA Wash Buffer l 离心10 000×g，1 min，倒掉收集管中的液体，再重复此步骤一次。将倒掉液体的管放入离心机，＞10 000×g，2 min，以甩干迷你管。将DNA 迷你管放入1.5 mL 的微型管中，往迷你管中加入100 μL 事先放入65℃水浴锅预热的Elution Buffer ，混匀在室温下静放3～5 min。放入离心机10 000×g，1 min，再将微型管中的液体重新移入DNA 迷你管中，再离心一次，将DNA 迷你管丢弃，将1.5 mL 微型管中的DNA液体放入4℃冰箱保存。

1.2.2.3 PCR反应

引物。Primer1：5＇-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3＇，Primer2：5＇-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3＇。

以上述得到的DNA 为模板，进行PCR 扩增，扩增体系：模板DNA 1 μL；10×PCR Buffer 2.5 μL；dNTPs 2 μL； Primer1 （10 μmol/L） 0.5 μL；Primer2（10 μmol/L） 0.5 μL；Ex-Taq 0.25 μL；加入ddH2O至总体积25 μL。

充分混匀后，置于PCR扩增仪中，按以下程序进行扩增：94℃预变性5 min；94℃变性30 s；60℃复性30 s，30 个循环；72℃延伸45s；72℃延伸10 min。

1.2.2.4 PCR产物的回收

用试剂盒法进行PCR产物的回收，所用试剂盒为OMEGA D3350-01Bacterial DNA Kit（50）。

将所有PCR 产物加入loading buffer 点样到琼脂糖凝胶的孔中，跑电泳，然后用干净、锋利的手术刀切割下目的DNA片段的琼脂块，称量重量。

（1）取含DNA片段的琼脂糖凝胶（100～300 mg），加入同等溶胶质量的Binding Buffer（XP2）。

（2）50℃水浴7 min，胶完全融化即可。

（3）将上一步所得的溶液都加入到一个HiBind DNA 迷你吸附柱中（吸附柱放入收集管中）。10 000×g离心1 min。倒掉液体。

（4）将吸附柱放到同一个收集管中，加入300µL Binding Buffer（XP2）于吸附柱中，10 000×g离心1 min。倒掉液体。

（5）向吸附柱中加入700 µL 加过无水乙醇的SPW Wash Buffer，清洗吸附柱，10 000×g离心1 min，倒掉废液。重复一次。

（6）将吸附柱放回收集管中，13 000×g 离心2 min，甩干剩余液体，倒掉废液。

（7）将离心柱置于新的离心管中，加入30µL的Elution Buffer，13 000 r/min离心1 min。将溶液收集到离心管中。

1.2.2.5 连接 于0.2 mL 离心管中配置试剂：加入3 μL 的ddH2O，然后加入1 μL 的模版，1 μL 载体，充分混匀后放入PCR扩增仪，25℃连接15 min，4℃放置30 min。

1.2.2.6 转化

从-80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞Top10，冰上融化，加入连接产物5 μL于50 μLTrans1-T1 感受态细胞中，轻弹几下，冰浴20 min，42℃恒温水浴热激30 s，立即置于冰上冷却2 min，加入250μL平衡至室温的soc/LB，置于37℃，200 r/min的摇床上培养1 h，取80 μL，500 mmol/L IPTG，40 μL，20 mg/mL X-gal 混合均匀，涂布于准备好的LB 培养基上（含Amp），在37℃正放置30 min。待前两种物质被吸收后，取200 μL 菌液涂板，干燥后放37℃培养箱中过夜培养。

2 结果与分析

2.1 内生细菌分离结果

运用常规组织分离方法及涂抹对采集的竹柏叶进行内生菌分离，经过2～5 d 的培养，未发现空白对照处理有菌落长出，表明组织表面消毒彻底，因此可以认为获得菌株为植物的内生菌株，分离得到ZB（1、2、3、4、5、6） 6株内生细菌。

2.2 内生细菌对靶标菌的拮抗作用测定结果

采用皿内培养法将8株供试植物病原指示菌分别对ZB（1、2、3、4、5、6）6 株菌株进行对峙试验培养，试验结果如表1。

从表1 中可以看出，ZB（2、3、4、6）对各病原菌有一定的抑制效果，其中ZB2对香蕉炭疽病菌抑制效果最明显，拮抗菌株筛选结果见图1～6。

表1 内生细菌对8株供试植物病原指示菌的皿内拮抗作用测定结果

图1 ZB2和ZB6对香蕉炭疽病菌的抑制

图2 ZB2对灰斑病菌的抑制

图3 ZB2、3和4对香蕉枯萎病菌的抑制

图4 ZB3和ZB4对棒孢病菌的抑制

图5 芒果蒂腐病菌对ZB5和ZB6的抑制

2.3 拮抗菌DNA提取的效果

提取结束后，取3 μL 产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，在全自动凝胶成像分析系统上观察、拍照并记录结果，见图7。

2.4 PCR反应结果

PCR 反应结束后，取3 μL 扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，在全自动凝胶成像分析系统上观察、拍照并记录结果见图8。

2.5 PCR产物回收效果

1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测并拍照见图9。

3 结论与讨论

植物内生细菌分离获得数量的多少与消毒剂及其作用时间有密切关系。消毒剂杀菌能力越强，作用时间越长，表面消毒就越彻底。同时，植物体内浅表层的部分内生细菌也被杀死，获得的内生细菌较少［7］。为了尽量排除竹柏表面细菌的干扰，表面消毒剂采用不同的时间处理，故从竹柏内只分离到6株内生细菌，数量较少。

图6 ZB1、2和6对西瓜枯萎病菌的抑制

分离内生菌是确定内生菌数量的关键步骤，但即使使用不同种类的培养基来培养植物组织也不能确保将植物组织中所有内生菌全部分离出来，有些内生菌不能在人工培养基上生长，有些内生菌生长缓慢被生长相对较快的菌株所覆盖。试验所用的培养基为常见的培养基，很有可能某些稀有菌株无法生长，使得分离的内生菌不够全面。本试验获得内生菌比较少，一方面与植物本身有关，另一方面植物内生菌分离因取样、培养基选择不同，其数量也会存在较大差异。试验分离时做了空白对照，并无菌长出，并且在前人的基础上缩短了消毒时间，以防杀死一部分内生菌。目前尚无统一的定性定量分析方法［8］。

图7 DYSL5和LR5的DNA电泳图

图8 PCR产物电泳图

图9 PCR产物回收电泳图

4 展望

世界上大约有30 万种植物，目前人们仅仅研究了其中的几百种［9-14］，主要是关于防治植物病害的植物内生菌研究报道比较多，并且这些内生菌已在防治细菌性和真菌性病害上发挥了巨大的作用，但对极端环境中生长的植物及海洋植物的内生菌研究很少，而这些植物的内生菌更有可能产生一些特殊的有价值的生物活性物质，随着人们对植物内生菌的发现、驯化和改造，内生菌必将在微生物制药、病原微生物防治、环境改造等方面产生巨大的作用；同时有望从中寻找到更有效的药物用于病虫害防治和维护人类健康［15］。

植物内生菌作为生防资源的应用潜力巨大，具有广泛的研究价值和广阔的应用前景，随着研究的深入，植物内生菌将成为生物防治潜在的生物资源，同时在农业发展以及环境保护方面都具有不可估量的价值。因此，对植物内生菌的进一步深入研究势在必行。