李 馨, 刘吉升, 周玉萍, 刘顺枝, 覃 希, 田长恩

(广州大学 生命科学学院, 广东 广州 510006)

分子生物学以遗传学、生物化学、微生物学等为基础,从分子水平揭示生命现象,是生命科学的核心,已成为当今世界的一个主干学科。基因工程是分子生物学的工程应用,是以分子生物学为基础,对生命现象进行工程改造的新兴技术学科。分子生物学和基因工程是生命科学最重要、发展最快的领域,在医疗、制药、食品、农业、化工、环境保护和能源等行业,已经、正在并将继续产生巨大的效益。例如：基因工程已经广泛应用于制药产业,用于药物和疫苗等的研发、改造和生产,在人类健康领域发挥巨大推动力；植物基因工程在作物育种中,对提高作物产量、品质和抗逆性等方面有重要作用[1]。以基因工程为核心的生物技术是当代高新技术,生物技术产业正在成为许多国家的战略性新兴支柱产业。生物工程专业在这些领域有广阔的发展和就业前景,相应地也需要以基因工程为主干内容的生物工程上游技术综合实验不断改革发展,从而更加注重培养学生的综合实践能力和创新能力,以适应不断创新发展的生物工程和生物技术产业需求[2]。

1 改革的必要性

1.1 生物工程上游技术实验概述

生物工程是以现代生命科学为基础,综合基因工程、 细胞工程、 酶工程、 发酵工程和蛋白质工程等新技术手段而成的,实验性和应用性极强, 因此必须加强实验教学, 以提高教学质量[3-4]。教育部高等学校生物科学与工程教学指导委员会分别在《生物工程专业规范》(2006年)[5]和《生物工程专业介绍》(2011年)中将“分子生物学与基因工程实验”列为核心实验课程,在生命科学另外2个本科专业(生物科学专业、生物技术专业)也被列为核心实验课程。国内外不同大学的生物类学科都开设了分子生物学与基因工程实验课程。

分子生物学和基因工程作为生命科学发展的最前沿,研究技术和研究成果日新月异,国内很多高校都在对相应的课程实验的内容和方法进行改革。复旦大学的基因工程实验内容不但包括原核生物,也包括哺乳动物细胞系,并加入基因可变剪接、功能分析和表达水平定量分析等内容,不但将较新的技术引入实验教学,同时也让学生对于基因工程过程有更全面的理解,并激发他们的学习兴趣和科研兴趣[6]。湖南师范大学的袁婺洲等利用自身科研平台,将制作转基因斑马鱼引入基因工程实验课,从通过进行动物表达载体构建和通过显微注射进行转基因,到筛选和鉴定转基因或嵌合体后代,让学生系统理解完整的动物基因工程流程[7]。内蒙古的林晓飞等,在基因工程实验中加入制作转基因拟南芥的内容[8]。这些教学改革注重综合性和创新性,结合科技发展前沿研究成果,教学成效较好。

广州大学生命科学学院自2003年起,开始在生物工程专业开设基因工程实验。为了对接生物技术产业,广州大学生命科学学院首创性地提出了生物工程专业实验改革方案,设置了生物工程上游技术实验、生物工程中游技术实验和生物工程下游技术实验,整合取代原有的实验。该方案于2005年4月通过了广州大学教务处组织的“生物工程专业实验体系改革”论证,2名全国高校生物科学与工程教指委成员参加了论证。随后,陆续为生物类不同专业开设了相应的实验课程,包括生物工程上游技术实验(生物工程专业,64学时)、现代生物技术综合实验(生物技术专业,48学时)、分子生物学实验(生物科学专业32学时)。其中,后2门实验课程是从生物工程上游技术实验中精选的与专业相关的实验项目。

生物工程上游技术实验将“分子生物学实验”“基因工程实验”及“微生物遗传育种实验”等多门实验课程,有机地统一成一体[9]。将这些实验课程整合成若干项基础性、设计性和综合性实验,形成一个完整的实验教学体系,既能节约成本,又能使学生更加系统地掌握实验的基本技术。实验技术也更加接近本学科的前沿,包括：感受态细胞的制备和转化；转化子的筛选；DNA和RNA的提取；基因表达的RT-PCR分析；质粒的提取、酶切和凝胶电泳；多聚酶链式反应(PCR)；PCR产物的纯化、克隆和转化；转化子的鉴定等。实验上一环扣一环,前一次实验的结果是后一次实验的材料。所以学生对待每次实验,都必须小心谨慎,课前需认真预习,实验需严格操作,学生的学习习惯和科研态度明显改善。

通过本课程的学习,学生可系统掌握很多分子生物学的基本实验技术,包括：DNA、RNA提取和质量分析；DNA的限制性酶切和目的片段的分离；质粒的扩增和提取等。这些基本实验技术将为后续的基因工程等实验课程奠定良好基础。在基因工程和微生物遗传育种实验技术方面,始终围绕本实验室研究较多的蛋白质(如拟南芥生长素反应因子8或钙调素5的生物工程实验技术而展开,从蛋白质的编码基因着手,利用PCR扩增该基因,将该基因克隆于适合在受体菌中表达的载体,并将表达载体导入到受体菌,然后利用表型、选择标记或者分子标记进行转基因后代的筛选和鉴定。学生通过实验,可清晰掌握上游技术实验的精髓。以此为基础,田长恩主编的《生物工程上游技术实验手册》,作为“十一五”国家重点图书出版规划项目——应用生物技术大系系列图书在科学出版社出版[10]。

1.2 目前生物工程上游技术实验的问题及改革设想

尽管如此,目前的生物工程上游技术实验尚存在一些问题。

首先,在初步建立的实验项目体系中,使用拟南芥生长素反应因子8基因的片段作为实验对象,尽管可方便基因克隆和鉴定,但却无法通过方便的RT-PCR和表型观察分析其表达情况。在优化的实验项目体系中,用拟南芥钙调素5基因作为实验对象,既可方便基因克隆和鉴定,也可用RT-PCR分析其表达,但却无法方便地进行表型观察。因此,找到一个方便观察表型的基因十分重要。绿色荧光蛋白基因分子不大,其编码蛋白在蓝光下具有绿色荧光,观察十分方便,设备要求简单。故本研究在实验项目优化中首先构建方便遗传操作和转基因产物观察的、载有绿色荧光蛋白基因的表达载体,转化、鉴定获得转绿色荧光蛋白基因的大肠杆菌,用于实验教学。

其次,原实验课程主要内容包括原核表达质粒的构建、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化,以及对受体菌的筛选和鉴定,均是原核生物基因工程的内容,而没有包括真核生物基因工程的内容。因此,在对实验内容进行优化过程中,加入高等植物的基因工程,利用原生质体转化,将绿色荧光蛋白基因转入水稻,构建外源目的基因的瞬时表达体系,并对目的基因的表达产物进行鉴定,利用荧光显微镜表型直观观察绿色荧光。

再次,实验课程教学方式也可进一步优化。目前除最后一次为设计性实验外,本课程大部分实验教学方式较为传统,学生参与文献查阅、实验方案设计、预实验和实验准备不够,造成部分学生学习被动,机械重复实验方案,求知欲不强,学习主动性未能充分发挥,影响学生对分子生物学和基因工程相关学科理论知识的掌握和对实验整体技术路线和原理的理解,造成学生对实验设计的可靠性和科学性理解不够,解决问题能力和数据分析能力较差。

2 改革内容

针对上述问题,对生物工程上游技术实验教学,进行了从内容到教学方式、考核方式的改革。

2.1 结合科研优势改革课程内容

在新工科背景下,高校工程技术实验课程教学模式正在经历改革[11],其中一个热点就是将科研实验转化为教学实验[12]。我校“生物工程上游技术实验”面向生物工程专业大三学生,开设在第六学期下半学期。在本课程之前,学生已经完成细胞生物学、分子生物学、遗传学和部分基因工程等专业基础课程及其相关实验,掌握了大分子DNA提取、聚合酶链式反应、限制性内切酶实验等分子生物学基础技术,具备了较为全面的生物工程相关知识和实验技术，在此基础上开设了这门更具连贯性、系统性和设计性的综合性实验,提高学生的综合实践能力和创新能力。

本课程教研组成员的主要研究领域为植物遗传学,具体方向为植物抗逆基因的发现和功能研究。结合教师的研究方向,发挥自身领域的优势和专长,将研究工作中常用的高等植物基因工程引入实验课程中,依托较为完备的科学研究平台,把教师在研究工作中积累的成熟研究方法、实验模型和体系,以及科学实践经验运用到教学工作中。

本实验课程一方面保留了原课程中的质粒DNA提取、质粒构建、原核生物转化和重组验证等经典内容,同时结合生物科学和技术的发展前沿,增加了真核生物转化、转基因植物瞬时表达体系的构建和鉴定等内容。本课程的主要设计流程是：提取包含绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)基因的质粒；使用PCR技术扩增所需目的基因GFP；将目的基因与细菌植物双元瞬时表达载体进行重组；使用化学法制备和转化大肠杆菌感受态细胞；筛选阳性重组子等。通过荧光显微镜观察绿色荧光、提取mRNA逆转录cDNA,进行PCR检测或者提取目的基因表达产物GFP,并进行Western蛋白质印迹分析,来检测外源目的基因是否转入大肠杆菌中,并表达成功,从而筛选转入GFP基因的转基因受体菌。经鉴定后,从成功转入目的基因的大肠杆菌重组子种提取质粒,制备水稻的原生质体,利用原生质体转化法将目的基因GFP转入水稻原生质体,通过荧光显微镜观察瞬时表达的GFP的绿色荧光。

与改革前课程的实验流程相比,做了如下创新。

首先,实验不但包括原核生物的基因克隆,还包括真核生物水稻原生质体的转化。从包含目的基因的大肠杆菌中提取质粒,然后以质粒为模板,使用PCR技术扩增目的基因,将目的基因插入细菌和植物双元质粒,构建重组表达质粒,通过化学方法制备和转化大肠杆菌感受态细胞,进而将质粒转化水稻原生质体。

其次,传统生物工程实验一般利用PCR来筛选和验证外源基因的导入和正确表达,而改革后的课程,学生在前期学习的基础上,通过查找文献自行确定和撰写筛选转化子以及转化植物细胞的实验方案。学生设计的鉴定方法,不但包括传统DNA层面的检测,也包括转录水平和蛋白质水平的检测,具体包括：从转化的细胞中提取总RNA,通过逆转录获取cDNA,使用GFP特异性引物进行PCR或定量PCR,对外源基因的表达进行转录层面的检测；从细胞中提取蛋白质,利用抗GFP特异性抗体进行Western蛋白质印迹检测目的蛋白；利用荧光显微镜观察活体水稻细胞,检测GFP的荧光。

在新实验课程中,学生可以学习和操作更多方面的分子生物学和基因工程技术,与理论知识有效结合,加强与其他课程内容(如植物学)的联系,对生物工程上游技术的理解更加完整和连贯。

2.2 建立自主研究型教学模式

为了提高学生独立创新和解决问题的能力,提升他们对科学研究的兴趣,培养创新型人才,也对教学模式进行了改革。本课程具有连贯性特点,只有完成前面的实验后才能进行后续实验,而且部分实验所需时间较长,实验进度较难统一,为此,采取了前期实验统一讲解统一操作,后期实验则由学生自主设计、独立实验并撰写课程论文的教学模式。

在前期的提取质粒、PCR、PCR产物的纯化和克隆、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化、筛选目的转化子和细菌培养(见图1)等实验中,由教师制订实验方案,统一讲解实验原理和实验步骤、实验设计思路、相关技术的目的和要点及常用实验设备操作规范等,帮助学生理解各项技术原理,熟悉实验操作和实验室规范,掌握实验设计方法,使他们在实践中融会贯通理论知识,为后期的设计性实验打好基础。在后期利用不同方法筛选和鉴定转化大肠杆菌细胞,以及原生质的制备、转化和鉴定实验中,采用研究型实验的教学方法。

在实验开始前,要求学生阅读大量文献,了解现代基因工程实验的主流常用技术,结合植物学、分子生物学等相关课程,以及前期的实验,自主制定实验方案,包括自主选择鉴定导入外源基因并表达目的蛋白的大肠杆菌细胞的方法、从筛选获得的目的转化子中提取质粒的方法、制备水稻原生质体的方法、将质粒转入原生质体的方法等。在开始实验前,学生需提交实验设计和技术路线方案,再经过课堂讨论,并在教师指导下,修改完善实验方案。学生按照修改完善后的方案,独立操作完成后续实验。考虑到每个学生的实验方案不同,实验进度和所需时间有差异,在实验课程期间,全面开放实验室,由学生自行安排。同时,教师和实验室人员对学生的实验进行监督,保证实验过程安全规范,并解答学生在操作中的疑问。

图1 改革后生物工程上游技术实验流程

在实验完成后,学生将提交学术论文形式的课程论文,包括摘要、前言、材料和方法、结果和讨论,以及结论等。在此过程中,学生不只完成实验报告,而是要将整个生物工程上游技术实验视为一个科研项目,要提取目的基因,将其转入大肠杆菌和植物,并予以正确表达；要综述中外研究进展,阐述实验设计思路；要利用适宜的统计方法处理数据,分析实验结果,并讨论实验过程中存在的问题。

这项课程论文及自主实验前的实验设计报告占实验课程总成绩的50%,前期实验的报告占总成绩的另外50%。

这样的教学方式使学生不是机械地完成重复性实验,单纯学习生物工程技术操作,而是能更深刻地理解技术的原理,并将技术作为手段用于一项连贯完整的科学研究。更重要的是,通过一个实验课程,使学生既可学习实验设计的思路,理解实验设计的可行性和可靠性,又可在此过程中培养严谨的科学思维,提高综合处理问题能力和创新能力。同时,通过自行设计实验和独立操作,完成一个完整的转基因过程,并得到明确的实验结果,特别是直观地观测到绿色荧光蛋白的荧光,能够提高学生的成就感,增强他们对科学研究的兴趣。

3 结语

本次生物工程上游技术实验的改革,结合课程教研组教师的科研方向,以细菌和植物基因工程为中心,将课程内容从传统的原核生物扩展到高等植物,加入更多较新的、科研实践中应用性强的生物技术,通过连贯性强的实验流程和独立设计实验,着重培养了学生独立思考、独立实践和综合创新能力,提升了他们对科研工作的兴趣。