将荧光检测技术引入本科实验教学的实践与探索

2019-04-03吴胜龙何婉芬

实验技术与管理 2019年3期

叶君, 熊犍, 吴胜龙, 何婉芬

(华南理工大学轻工科学与工程学院, 广东广州 510640)

2008年的诺贝尔化学奖颁发给了下村修、马丁·查尔菲和钱永健,以奖励他们在绿色荧光蛋白(GFP)领域的突出贡献[1]。瑞典皇家学会诺贝尔化学奖评选委员会对绿色荧光蛋白的评价指出,绿色荧光蛋白已经成为现代生物科学的重要工具之一[2]。以2008年诺贝尔化学奖为契机,荧光探针技术受到了人们的广泛关注[3-6]。经过多年探究,绿色荧光蛋白在生物医学界已经得到非常广泛的应用,以绿色荧光蛋白为基础发展起来的多色荧光探针技术广泛应用于生物标记、免疫学、遗传学等领域[7-11]。

本文将科研新成果应用到本科实验教学中,构建一种合成条件温和、操作简单的新型稀土荧光探针羧甲基纤维素/Tb(Ⅲ)复合物,应用于自来水中Mn2+的检测。在整个实验过程中,学生应用自己合成的荧光探针检测自己生活和工作中的用水,不仅提高了本科生在学科领域中的前瞻性,而且实验的实用性强、趣味性高,教学质量大大提高,有利于培养本科生的创新思维和创新能力。

1 实验

1.1 CMC/Tb (Ⅲ) 复合物的制备

将3×10-4mol的TbCl3溶液,缓慢滴加至1%(w%)的羧甲基纤维素(CMC)的溶液中,并辅以搅拌,调节pH值至7,在70 ℃下反应30 min,冷却至室温,用透析袋透析,用浓度为0.1 mol/L的AgNO3溶液检测透析液中的Cl-,直至透析液无白色沉淀为止,然后将样品置于60 ℃下烘干备用。该反应产物的结构表征,如傅里叶转化红外、扫描电镜等均与文献[12]一致,说明所合成的产物为CMC/Tb(Ⅲ)复合物。

1.2 MnCl2标准溶液的配制

准确称量0.125 9 g的MnCl2固体,置于小烧杯中,加入适量的去离子水溶解后,移至10 mL的容量瓶中定容,得到浓度为0.1 mol/L的MnCl2溶液。用移液管移取不同体积的新鲜溶液,分别在100 mL的容量瓶中定容,得到浓度分别为1 mmol/L、0.8 mmol/L、0.6 mmol/L、0.4 mmol/L、0.2 mmol/L、0.1 mmol/L、0.08 mmol/L、0.06 mmol/L、0.04 mmol/L、0.02 mmol/L、0.01 mmol/L、1 μmol/L、0.1 μmol/L的MnCl2标准溶液。

1.3 荧光探针对Mn2+的检测

用移液管分别移取不同浓度的MnCl2溶液加入到1%的 CMC/Tb(Ⅲ)悬浮液中,将其混合均匀,反应3 min后,移至石英比色皿中,置于荧光光谱仪中以波长为 370 nm的激发光激发检测其荧光光谱,通过对CMC/Tb(Ⅲ)荧光探针荧光光谱特性的变化的研究,探究不同浓度的Mn2+对CMC/Tb(Ⅲ)荧光探针荧光性质的影响。

1.4 荧光探针对自来水中的Mn2+的检测

采用加标回收法[13]检测自来水中Mn2+的浓度。实验中所用的自来水采集自某大学的食堂、宿舍及实验室3个不同的供水系统。将不同量的MnCl2加入到上述水样中,制得浓度为10 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L的MnCl2标准溶液。将不同浓度的MnCl2标准溶液,分别用移液管移取0.6 mL,加入至 2.4 mL质量浓度为1%的CMC/Tb (Ⅲ)荧光探针中, 反应3 min后,测试其荧光强度的变化。测试条件与以上实验条件保持一致。

2 实验结果与讨论

2.1 荧光探针的选取

不同浓度的CMC/Tb (Ⅲ) 悬浮液在波长为370 nm的激发光激发下的荧光性质如图1所示。从图1的荧光发射图谱中,可以观察到在489、544、585 及 606 nm处共有4个发射峰,他们分别归属于从Tb3+的5D4能级到7FJ(J = 6, 5, 4, 3)能级的电子跃迁[14],这说明制备的CMC/Tb(Ⅲ)悬浮液展现出铽的特征发射图谱。此外,随着CMC/Tb (Ⅲ)浓度的增加,CMC/Tb (Ⅲ)悬浮液的荧光强度FI也在不断增加。当悬浮液的浓度控制在1%时,该悬浮液依旧具有很高的荧光强度,该强度仍可满足后续实验中对CMC/Tb(Ⅲ)荧光探针的荧光强度的检测要求,并且该浓度条件下的悬浮液仍然具有很高的同质性和稳定性,出于成本和对环境保护等方面的综合考虑,采用质量浓度为1.0%的CMC/Tb (Ⅲ) 悬浮液作为后续实验的荧光检测探针。

图1 不同浓度(0.5%～5%)的CMC/Tb(Ⅲ)悬浮液荧光光谱对比

2.2 CMC/Tb(Ⅲ)荧光探针对水溶液中Mn2+ 检测的选择性

图2 阳离子对CMC/Tb (Ⅲ)荧光强度的影响

阴离子对CMC/Tb (Ⅲ)荧光探针荧光强度的影响如图3所示。与上述阳离子的影响类似,当Mn2+加入至上述其他金属离子与CMC/Tb(Ⅲ)荧光探针的混合溶液后,CMC/Tb(Ⅲ)荧光探针在544 nm处的荧光强度出现明显下降。这表明其他的金属离子及阴离子对CMC/Tb(Ⅲ)荧光探针的荧光强度并没有明显的影响,且当其他阳离子存在时并不会对Mn2+与CMC/Tb(Ⅲ)的相互作用产生干扰,也就是说CMC/Tb(Ⅲ) 荧光探针对Mn2+的检测具有很好的选择性。

图3 阴离子对CMC/Tb(Ⅲ)荧光探针荧光强度的影响

2.3 CMC/Tb(Ⅲ)荧光探针对水溶液中Mn2+ 的荧光响应

为了确定CMC/Tb(Ⅲ)荧光探针在对Mn2+检测的应用表现,如检测的灵敏性等,考察了不同浓度的Mn2+对CMC/Tb (Ⅲ)荧光探针荧光强度的影响,结果如图4所示。

图4 不同浓度的Mn2+对CMC/Tb(Ⅲ)荧光强度的影响

在加入Mn2+后,荧光探针依旧表现出铽的特征发射光谱,但是随着Mn2+浓度的增加,CMC/Tb(Ⅲ)荧光探针在544 nm处的荧光强度也随之降低,当 Mn2+的浓度增加至1 mmol/L时,CMC/Tb(Ⅲ)荧光探针在544 nm处的荧光强度降低至最初强度的23.4%。另外,当以365 nm紫外光照射CMC/Tb(Ⅲ)荧光探针时,可以观察到明显的绿色荧光,随着Mn2+浓度的增加,CMC/Tb (Ⅲ) 荧光探针在紫外灯下发射的绿色荧光也逐渐变弱,直至完全消失。CMC/Tb(Ⅲ)荧光探针的这种可见绿光颜色的变化,有助于通过肉眼对水溶液中Mn2+的存在与否进行快速直观的判断。更重要的是,当Mn2+的浓度范围在0.1～100 μmol/L时, CMC/Tb (Ⅲ)荧光探针在544 nm处的荧光强度与Mn2+的浓度之间具有良好的线性关系(相关系数R2=0.9924)。用Borràs方法[15]得到其检出限为0.046 μmol/L(信噪比为3),该检出限远低于美国环境保护署(0.3 mg/L)以及世界卫生组织(0.4 mg/L)在饮用水中的最高限量标准[16]。通过以上的分析和讨论,发现CMC/Tb(Ⅲ)荧光探针对于水溶液中Mn2+的检测具有很高的灵敏性。

2.4 CMC/Tb (Ⅲ) 荧光探针对Mn2+的荧光响应时间

为了提高CMC/Tb (Ⅲ)荧光探针在Mn2+检测中的准确度,研究了二者之间的响应时间对荧光强度的影响。如图5所示,Mn2+对CMC/Tb(Ⅲ)荧光探针的荧光响应非常迅速,在1 min内荧光响应已经几乎达到稳定状态,这表明CMC/Tb (Ⅲ)荧光探针对水溶液中的Mn2+具有快速响应的能力,可以实现对水溶液中Mn2+的快速检测。为了确保Mn2+与CMC/Tb (Ⅲ) 荧光探针之间能够完全反应,使实验具有更高的准确性,选择反应时间为3 min作为在实际应用中的检测时间。

图5 反应时间对CMC/Tb(Ⅲ)荧光探针荧光强度的影响

2.5 自来水中Mn2+的检测

为了进一步证明该探针在实际环境中的可用性和实用性,采用加标回收法对CMC/Tb(Ⅲ)荧光探针在检测自来水中的Mn2+的应用表现进行了研究。将不同量的MnCl2样品加入到自来水中配置得到MnCl2的标准溶液,以CMC/Tb(Ⅲ)作为荧光探针对该样品进行检测,结果如表1所示。Mn2+在标准自来水溶液中的回收率在97.10% 到101.61%之间,并且所有样品的相对标准偏差(RSD, n=5)小于2.04%。这些数据表明,CMC/Tb(Ⅲ)荧光探针在自来水中Mn2+的检测中显现出很好的准确性和可行性。