罗 晨 金永鑫 刘洁琳 刘 雅 陈艳语 李 闯 孙东东 王佐广 温绍君

血脂异常也称高脂血症，是指血清中TC或TG水平的升高，在实际应用中也包括HDL-C水平降低在内[1]。血脂异常与动脉粥样硬化密切相关，多项国内外前瞻性队列研究表明，血清TC或LDL-C升高是冠心病和缺血性卒中的危险因素之一，因此防治血脂异常对预防心血管疾病的发生非常重要[2-5]。血脂异常的发生发展除与饮食、运动、吸烟等环境因素有关外，也与遗传因素相关，某些基因缺陷可导致严重的高TG血症或高TC血症，而某些基因位点的变异也使得不同个体在脂质吸收、分解、合成代谢等方面存在差异[6]。

缓激肽释放酶基因1（Kallikrein 1，KLK-1）位于人类19号染色体，其表达产物为缓激肽释放酶，它主要参与体内缓激肽的生成。缓激肽除有介导血管舒张、血管壁通透性增大等功能外，也有研究表明它还与胰岛素敏感性相关[7]。rs5516为KLK-1基因上的一个错义突变，这个突变导致其翻译产物第145位上的氨基酸由谷氨酸转变为谷氨酰胺，有研究推断其可能与其他有功能的突变位点相互作用从而影响KLK-1基因的表达[8]。因此我们推断KLK-1基因上的rs5516位点多态性可能通过影响胰岛素作用方式从而进一步对血脂代谢产生影响。而国内外少有针对这一方面开展的研究，本文就这一问题进行了分析。

材料与方法

1.研究对象 选取2008年10月至2009年6月，于北京安贞医院体检中心及周边社区接受健康体检的无血缘关系参与者645例。所有入选对象均无一、二级亲属关系，入选前2周未服用调节血脂药物及其他对血脂水平有影响的药物。排除糖尿病、甲状腺疾病、肾衰竭、继发性高血压、心肌病、瓣膜疾病、冠心病及恶性肿瘤的患者。所有入选的研究对象均已签署知情同意书，研究方案经过首都医科大学附属北京安贞医院医学伦理道德委员会批准，研究内容符合《赫尔辛基宣言》。

2.方法 （1）临床信息收集：详细记录研究对象的临床信息。血压的测量采用标准水银血压计，测量前受试者至少休息15 min，坐位连续测量3次，每次间隔不少于5 min，取3次平均值。吸烟者界定为受试者曾吸烟总数≥100支；饮酒者定义为受试者年饮酒次数≥12次[9]。

（2）临床生化指标的检测：受试者禁食12 h后，抽取肘正中静脉血4～5 mL（EDTA-2Na抗凝），以3 000 r/min，离心20 min，分离血细胞与血浆，血浆当日做生化检测，血细胞于80℃冰箱保存，用于基因多态性检测。生化指标的检测包括：TC、TG、HDLC、LDL-C、GLU等[10]。

（3）基因多态性检测：用EDTA抗凝的采血管收集研究对象的外周静脉血3-5 mL，保存于-20℃冰箱中。采用改良的酚-氯仿法抽提基因组DNA。利用TaqMan MGB等位基因分型试剂盒根据说明书进行操作，在9700型高通量荧光定量PCR仪上进行PCR反应，最后经ABI HT 7900型荧光扫描仪扫描。用SDS 2.0图像分析软件Allelic Discrimination程序进行终点分析，通过检测不同等位基因所标的FAM和VIC荧光强度，判断各待测样本基因分型为野生纯合子、杂合子还是突变纯合子[11]。

3.研究对象分组 血脂异常诊断标准参考《中国成人血脂异常防治指南（2016年修订版）》，满足TC≥6.2 mmol/L，或TG≥2.3 mmol/L，或LDL-C≥4.1 mmol/L，或HDL-C＜1.0 mmol/L之一者即划入血脂异常组，4项血脂指标均不满足上述条件者划入正常对照组。满足TC≥6.2 mmol/L或LDL≥4.1 mmol/L，且TC＜2.3 mmol/L为高胆固醇血症；满足TG≥2.3 mmol/L，且TC＜6.2 mmol/L、LDL＜4.1 mmol/L为高甘油三酯血症；满足TC≥6.2 mmol/L或LDL≥4.1 mmol/L，且TG≥2.3 mmol/L为混合型高脂血症；满足HDL＜1.0 mmol/L为低HDL-C血症[1]。高血压诊断标准参考《中国高血压防治指南2010》，满足SBP≥140 mmHg（1 mm Hg=0.133 kPa）和（或）舒张压≥90 mmHg者划入高血压亚组，不满足上述条件者划入非高血压亚组[12]。

4.统计学分析 运用SPSS 23.0统计学软件进行数据库建立和统计学分析。正态分布计量资料以均数±标准差表示，非正态分布资料采用中位数（M）及四分位数间距（P25，P75）表示。以Kolmolgorov-Smirnov法对计量资料进行正态分布检验，用Levene法进行方差齐性检验；如数据呈正态分布且满足方差齐性，则采用独立样本t检验或单因素方差分析进行组间比较；如不满足上述条件，则用Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis H检验进行组间比较。计数资料以频数（率）表示，采用χ2检验进行比较分析，如超过1/5的格子理论频数＜5，则应用Fisher确切概率法进行分析。采用Logistic回归分析或多元线性回归分析校正协变量，探索rs5516与血脂异常或血脂水平的相关性。遗传学Hardy-Weinberg平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）检验采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.rs5516与血脂异常相关性研究 （1）临床资料对比：研究对象临床资料见表1。共入选研究对象645例，其中血脂异常组320例，对照组325例，病例组与对照组性别、年龄匹配。病例组吸烟比例、SBP、DBP、BMI、TG、TC、LDL-C值高于对照组，差异有统计学意义。两组饮酒比例、GLU、HDL-C差异无统计学意义。

表1 血脂异常组与对照组临床资料对比[±s，M（QR），n（%）]

表1 血脂异常组与对照组临床资料对比[±s，M（QR），n（%）]

项目 血脂异常组（n=320）对照组（n=325） P值年龄/岁 52.86±9.46 52.97±9.59 0.880性别/（男/女） 218/102 221/104 0.973吸烟 111（35.4） 81（25.1） 0.005饮酒 85（27.0） 72（22.3） 0.169 SBP/mmHg 135.55±21.33 129.35±19.56 ＜0.001 DBP/mmHg 87.22±13.90 83.06±13.28 ＜0.001 BMI/（kg/m2） 26.56±4.04 25.49±3.36 ＜0.001 GLU/（mmol/L） 5.425（5.08，5.85） 5.42±0.98 0.060 TG/（mmol/L） 2.35（1.61，3.15）1.31（0.97，1.69）＜0.001 TC/（mmol/L） 5.44（4.63，6.18）4.81（4.30，5.26）＜0.001 LDL-C/（mmol/L）3.520（2.90，4.19） 3.10±0.63 0.021 HDL-C/（mmol/L）0.980（0.90，1.21）1.250（1.12，1.41）0.373

（2）rs5516基因型及等位基因频率对比：结果见表2。rs5516在对照组人群中符合HWE（χ2=1.24，P=0.26），表明本研究基因型分布具有人群代表性。在血脂异常组中rs5516位点CC、CG、GG基因型频率分别为3.1%、38.8%、58.1%，对照组相应基因型频率分别为4.9%、29.8%、65.2%，两组基因型分布有统计学差异（P=0.042）。C等位基因在病例组中分布频率为22.5%，G等位基因频率为77.5%；对照组中C、G等位基因频率分别为19.8%、80.2%，等位基因在两组中分布差异无统计学意义。

从表2中可以看出，CC基因型在病例组及对照组中分布频数均较小，可能会对检验效能有所影响，因此我们又将CC+CG合并为C等位基因携带者（CC+CG）进行分析。病例组中CC+CG频率为41.9%，对照组中为34.8%，两者差异无统计学意义。

（3）各遗传模型下rs5516与血脂异常相关性分析：结果见表3。在校正了可能对血脂水平产生影响的因素如年龄、性别、是否患高血压、饮酒、吸烟、BMI、GLU后，rs5516在等位基因模型（OR=1.216，95%CI=0.910～1.624）、加性模型（OR=1.226，95%CI=0.912～1.648）、显性模型（OR=1.379，95%CI=0.975～1.950）、隐形模型（OR=0.765，95%CI=0.319～1.837）、纯合子模型（OR=0.866，95%CI=0.357～2.099）中均与是否患血脂异常无显著相关性。

（4）亚组分析：结果见表2及表3。以往研究表明，rs5516与高血压存在相关性[8，13]。因此为排除高血压患者在病例组与对照组中分布不同而造成的偏倚，将研究对象分为高血压亚组与非高血压亚组进一步分析。在高血压亚组与非高血压亚组中，CC基因型在病例组中分布频率均低于对照组，但CC+CG均高于对照组，但这些差异均无统计学意义；而相较于对照组，等位基因C在病例组中有上升趋势，但差异亦无统计学意义（表2）。在高血压亚组与非高血压亚组的Logistic回归分析中，rs5516在各遗传模型下与血脂异常亦无明显相关（表3）。

表2 rs5516基因型及等位基因频率在总体及亚组中的对比[n（%）]

表3 rs5516多态性与血脂异常多元Logistic分析结果

表4 rs5516基因型及等位基因频率在各类型血脂异常中的对比[n（%）]

（5）各类型血脂异常分析：结果见表4。血脂异常定义包含了高胆固醇血症、高甘油三酯血症、混合型高脂血症以及低HDL-C血症，为进一步探究rs5516与血脂的相关性，将血脂异常患者细分为各类型高脂血症后进行分析。在高TC血症、高TG血症、混合型高脂血症以及低HDL-C血症中，CCCGGG基因型分布或CC+CGGG分布均无显著性差异（表4）。在Logistic回归分析中，rs5516在加性模型、等位基因模型、显性模型、隐形模型、纯合子模型中均与各类型血脂异常无明显相关（结果未列出）。

2.rs5516与血脂水平相关性研究 （1）临床资料对比：按基因型分组后研究对象临床资料见表5。基因型为CC、CG、GG的研究对象年龄、性别匹配，且3组间吸烟者、饮酒者比例差异无统计学意义，SBP、DBP、BMI、GLU水平也无显著性差异。C等位基因携带者（CC+CG）与GG基因型研究对象之间各临床指标差异亦无统计学意义。

（2）rs5516与血脂水平相关性分析：结果见表5及表6。基因型为CC、CG、GG的研究对象的TG、TC、LDL-C、HDL-C各指标差异均无统计学意义；同样，C等位基因携带者（CC+CG）与GG基因型研究对象之间各血脂指标差异亦无统计学意义（表5）。在多元线性回归分析中，经校正可能对血脂水平产生影响的因素后，rs5516与与各血脂指标水平无明显线性相关（表6）。

（3）亚组分析：结果未列出。在高血压亚组中，各血脂指标水平在CC、CG、GG的研究对象之间或C等位基因携带者（CC+CG）与GG基因型研究对象之间差异无统计学意义；经校正可能对血脂水平产生影响的因素，在多元线性回归模型中，各血脂指标水平也与rs5516无明显线性相关。非高血压亚组的分析结果亦然。

表5 各基因型研究对象临床资料对比[±s，M（QR），n（%）]

表5 各基因型研究对象临床资料对比[±s，M（QR），n（%）]

项目 CC CG GG P值 CC+CG GG P值年龄/岁 56.039±9.497 53.204±9.763 52.547±9.357 0.165 53.502±9.756 52.547±9.357 0.216性别/（男/女） 19/7 147/74 273/125 0.742 166/81 273/125 0.714吸烟 5（19.2） 59（26.9） 128（32.7） 0.156 64（26.1） 128（32.7） 0.081饮酒 7（26.9） 45（20.5） 105（26.7） 0.227 52（21.2） 105（26.7） 0.117 SBP/mmHg 128.539±18.221 133.931±20.636 131.843±20.838 0.303 133.359±20.427 131.843±20.838 0.368 DBP/mmHg 82.423±12.293 86.379±13.867 84.610±13.729 0.185 85.959±13.740 84.611±13.729 0.228 BMI/（kg/m2） 25.478±2.700 25.858±3.929 26.140±3.699 0.537 25.821±3.821 26.140±3.699 0.310 GLU/（mmol/L） 5.355±0.659 5.360（5.043.5.785） 5.544±1.116 0.430 5.360（5.038，5.783） 5.544±1.116 0.302 TG/（mmol/L） 1.425（1.025，1.645）1.780（1.243，2.480）1.630（1.160，2.253）0.127 1.660（1.220，2.435）1.630（1.160，2.253）0.232 TC/（mmol/L） 5.354±2.104 5.140（4.530，5.670） 5.167±1.293 0.243 5.120（4.53，5.67）4.990（4.44，5.64）0.471 LDL-C/（mmol/L） 3.184±0.756 3.385（2.710，3.918） 3.307±0.831 0.310 3.340（2.708，3.900） 3.307±0.831 0.180 HDL-C/（mmol/L） 1.268±0.272 1.110（0.960，1.330） 1.229±1.036 0.679 1.120（0.960，1.340）1.150（1.000，1.340）0.400

表6 rs5516与血脂水平线性相关分析

讨 论

缓激肽释放酶基因1位于19号染色体长臂1区3带3亚带，含有6个外显子。其表达产物为缓激肽释放酶，它是一种丝氨酸蛋白酶，分为组织型与血浆型，组织型以活性形式分布于胰腺、甲状腺、小肠等部位，血浆型则在血液中以无活性的前激肽释放酶形式存在，在其他蛋白酶水解下方可发挥作用。它的作用底物广泛，可特异性地水解底物中精氨酸与任意氨基酸之间的肽键，而其最为深入研究的功能是水解激肽原为赖氨酰缓激肽，赖氨酰缓激肽之后又可在血液中其他肽酶的作用下生成缓激肽，缓激肽与赖氨酰缓激肽便是人体激肽类物质中最重要的两种化合物[14-15]。缓激肽与赖氨酰缓激肽可发挥多种生物学功能，包括介导血管舒张、血管壁通透性增大以及痛觉产生等[16]。此外，缓激肽还可以增加胰岛素敏感性。以往研究表明，缓激肽与缓激肽受体B2结合后，可以激活磷脂酶C（phospholipase C，PLC）并促进三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）的产生，从而介导葡萄糖转运体4（glucose transporter 4，GLUT4）向细胞外的移位，这可以导致胰岛素受体磷酸化，从而增强胰岛素的作用；另一方面，缓激肽还可以通过产生一氧化氮（nitric oxide，NO）来增加组织毛细血管血流与通透性，从而更利于胰岛素与营养物质通过毛细血管到达组织[7，17]。因此，理论上讲，KLK基因突变可以对缓激肽生成产生影响，从而引发胰岛素抵抗，进一步引起各种物质代谢紊乱。然而，一些针对KLK-1的研究却得出了不同的结论，Zhao等[18]在高血压模型大鼠体内实现组织KLK-1基因过表达后，观察到了胰岛素从较高水平恢复至正常；而Potier等[19]的研究则表明KLK-1基因的缺陷可能对改善胰岛素抵抗有帮助。因此，KLK-1基因的改变与胰岛素抵抗及物质代谢方面的联系仍有待于深入探索。rs5516为KLK-1基因在第3个外显子的位置发生了碱基G向碱基C的错义突变，从而导致其翻译产物第145位上的氨基酸由谷氨酸转变为谷氨酰胺，Slim等[20]通过体外研究表明rs5516所引起的表达产物氨基酸替换并不会引起缓激肽释放酶活性的改变，但Jiang等[8]也推测rs5516多态性可能与其他有功能的突变位点相互作用从而影响KLK-1基因的表达。目前针对rs5516多态性的研究主要集中于大动脉瘤、动脉粥样硬化、高血压及降压药物反应性等方面[8，13，21]，尚无针对rs5516多态性与血脂方面的研究，而由上述理论我们可以推断KLK-1基因上的rs5516位点多态性可能与血脂代谢相关，因此本文就这一问题进行了探索。

从结果中我们可以看出，rs5516位点CC基因型在病例组中的频率要低于对照组，且这种差异有统计学意义，而C等位基因频率却在病例组与对照组之间无显著性差异；在相关性分析中，在校正了年龄、性别、饮酒、吸烟、BMI等因素后，亦未发现CC基因型或C等位基因与血脂异常有明显相关。因为人体血脂水平与多种因素相关，除遗传背景可影响血脂代谢外，饮食、运动、不良嗜好等都会使血脂水平产生不同程度的偏差[22-23]，因此我们认为校正了各种可能对血脂水平产生影响的因素后的相关性分析的结果更有代表性，即在整体人群中，未发现rs5516位点多态性与血脂异常的相关性。

以往研究表明，rs5516位点可能与原发性高血压的发生、发展相关，并且可能影响厄贝沙坦的降压作用[8，13]。而我们的入选对象中并未剔除高血压患者，因此，为了排除病例组与对照组中由于高血压患者分布不同而对结果产生的影响，我们进一步按是否患高血压进行亚组分析。在高血压亚组与非高血压亚组中，均未发现rs5516位点多态性与血脂异常有明显相关。

血脂代谢调控机制复杂，且甘油三酯、胆固醇的代谢途径也不尽相同，而血脂异常为包含多种血脂指标异常情况的总称，无法具体反映单个血脂指标与目标SNP的关系，因此我们猜测rs5516是否可能单独影响某种类型的血脂代谢。但在rs5516与各类型高脂血症与各项血脂指标水平的相关性分析中，我们仍未发现其与血脂代谢的相关性。

由上，虽然机制上讲rs5516多态性可能会通过影响胰岛素作用进而影响血脂代谢，但根据本次研究结果分析，尚不能认为rs5516位点多态性与血脂异常及血脂水平相关。产生这种与理论不符的原因我们分析如下：①缓激肽与胰岛素敏感性的关系各个研究的结果较为一致，但不同研究之间针对KLK-1基因改变与胰岛素抵抗的联系却存在分歧。这可能是因为在病理状态下，除缓激肽释放酶之外，其他可以催化产生缓激肽的酶也被激活，使得KLK-1基因表达生成的缓激肽释放酶并不是唯一甚至主要生成缓激肽的途径；此外，缓激肽释放酶发挥的具体作用还与肾素-血管紧张素-醛固酮系统以及瘦素等有着复杂的联系[24-25]。这些都使得疾病状态下KLK-1基因改变对于缓激肽生成的影响变得不甚明确，进而难以准确推断对胰岛素敏感性的具体作用。②如前所述，rs5516多态性是否会引起缓激肽释放酶活性改变或对下游通路产生影响尚需进一步探索。③本次研究在保证入选对象性别、年龄匹配的情况下，收集了尽可能大的样本量进行分析、对比，但更大样本量的研究将进一步提高检验效能，使可能作用较为微弱的SNP对血脂代谢的影响可以更明显表现出来。④血脂代谢受多种因素影响，尽管我们研究中已纳入了多种可能对血脂代谢产生影响的因素作为协变量进行分析，但性激素水平、运动情况等可以影响血脂水平的其他环境因素并未纳入回归方程进行分析，这可能导致研究结果在一定程度上存在误差。⑤血脂异常是遗传因素与环境因素共同作用的结果，此外，同一基因上不同位点或不同基因间的交互作用也都有可能对血脂代谢产生影响，因此开展环境与基因之间及不同基因之间相互作用的分析将对进一步完善血脂异常的发病机制具有重要意义。

综上所述，我们在较大样本人群中探索了缓激肽释放酶基因-1 rs5516多态性与血脂异常及血脂水平的相关性，尚不能推定rs5516与血脂异常及血脂水平相关。由于血脂代谢调控复杂，参与因素较多，因此未来除需在更大样本人群中进行高质量的研究外，探索环境-基因及基因-基因之间的相互作用及开展针对KLK-1基因与胰岛素抵抗及血脂代谢关系的基础研究将对进一步阐明血脂代谢紊乱的发生、发展机制有重要意义。