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胆酸-黄芩苷脂质体的制备

2019-04-01谭裕君冯玲玲

中成药 2019年3期
关键词:胆酸脂质体药量

谭裕君, 李 楠, 向 燕, 冯玲玲

(成都中医药大学药学院,四川成都611137)

黄芩苷是一种黄酮类化合物,为黄芩Scutellaria baicalensis Georgi有效成分之一,具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等药理作用,尤其在抗炎方面更显著[1-2];胆酸是一种甾体化合物,为多种动物胆汁的有效成分,具有解热、抗炎、抗过敏、抗菌、抗病毒活性,可通过抑制血管通透性、肉芽肿来发挥其抗炎作用[3]。以上2种成分可协同抗炎[4],但黄芩苷单独作用时由于其水溶性、脂溶性较差,口服生物利用度不高,从而限制了临床应用。

脂质体是一种类似双分子层微囊的结构,生物相容性良好,毒性低,包裹黄芩苷后可提高其稳定性与溶解度,具有良好的抗菌、抗炎作用[5],但该剂型口服后在胃肠道内不稳定,而加入一定胆盐后可作为磷脂膜组成成分,抵抗胃肠道内胆盐进攻,从而增加药物稳定性[6]。胆酸是胆酸盐合成原料,也为去氧胆酸、牛黄胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、石胆酸等成分的合成底物[6-7],同时可作为辅料,增加胆固醇在人体内的吸收[8]及药物在肝实质细胞中的蓄积[9]。

“药辅合一”是中药制剂学独有理念,即在不影响主药疗效的基础上添加适宜辅料,使其既可发挥相应作用,又可增强主药疗效[10],而胆酸正符合该思想。本实验将黄芩苷作为治疗结肠炎的主药,加入胆酸制备脂质体,并对其工艺进行优化。

1 材料

KQ-300VDB型双频数控超声仪 (昆山市超声仪器有限公司);RE-3000型旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂);UV-VIS-2550型紫外分光光度计(日本岛津公司);Zetasizer 3000型粒度测定仪(英国 Malvern公司);FEI Tecnai Spirit Tem 120 kV透射电子显微镜 (美国FEI公司);ZNCLBS 141∗140磁力搅拌器 (郑州华特仪器设备有限公司)。

在威远镇卓扎滩村建立马铃薯“下寨65”“青薯2号”“青薯9号”原种全程机械化作业示范区53.3 hm2,平均产量2.87×104kghm-2,总产量达152.97×104kg;实现收入3.44万元·hm-2,总产值183.56万元(按1.2元/kg计算);与露地常规栽培平均产量3.05×104kghm-2、收入2.75万元·hm-2(按0.9元/kg计算)相比,增收0.69万元·hm-2,新增产值36.78万元·hm-2。

黄芩苷原料药 (含有量90%,南京泽朗生物科技有限公司);无水胆酸原料药 (含有量98%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);大豆卵磷脂、胆固醇 (上海艾韦特医药科技有限公司);黄芩苷对照品 (中国食品药品检定研究院);透析袋(美国Viskase公司,分子截留量10 000)。三氯甲烷、乙醚均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 黄芩苷含有量测定

在这样的人生里,他遇到过数不清的形形色色的面孔,善良的,狡诈的,敦厚的,心机的,还有阴阳两面的,都无一例外在他的木偶戏里活脱脱地搬演过。他耍木偶耍得活灵活现,叫别人看得那么过瘾,而自己也正像木偶那样被生活中那些看不见的手摆弄过来摆弄过去,无论好坏都得受着。苦时“身上无衣又无盖,我冷冷清清,清清冷冷饿难挨”(《苏武牧羊》唱词),喜时“满园花儿齐开放,绿树荫浓细草长。”(《火焰驹·表花》唱词),人这一辈子啊,各种滋味都得尝都得受,虽然回头也不过是烟花一瞬,“哗”地就散了。

2.1.1 检测波长确定 精密称取适量黄芩苷,PBS(pH=7.0)溶解,在200~400 nm波长下进行全波长扫描,再制备空白脂质体,适量甲醇稀释后进行光谱扫描。结果,黄芩苷在276 nm处有最大吸收峰,在315.5 nm处有相对较强的吸收峰;空白脂质体在276 nm处有吸收,造成干扰,故选择315.5 nm作为检测波长。

这是到金江市区的唯独一条县级干道。看来今天是插翅难逃了。看到摩托车穷追不舍,胖子叫司机靠边停车,掏出电话向何泽说明了情况。何泽说,你们停下周旋一下,若能出点钱意思一下过去也行,不行就先拉到林业站,然后他来想办法。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取黄芩苷对照品适量,PBS制成3 mg/mL溶液,即得。

道德与文化都是与人类共生存的,二者有着密切的关系。在当下大数据时代,文化建设面临多方面挑战,出现了一种逆道德、反道德思潮。一方面是文化领域里道德的缺失,主要表现为文化的物化趋向,出现了泛商品化、消费化等现象;另一方面由于世界各种文化的交汇,中国传统文化一定程度出现了消解,导致了绝对价值的遮蔽,使文化的发展缺失了主导性价值目标。加强文化与道德关系的研究特别是道德的文化价值,对于推进新时代先进文化建设,减少道德失范现象的出现,不仅具有理论意义,而且对于促进社会和谐有着一定的应用价值。

2.1.9 包封率、载药量测定[11-12]

2.1.5 精密度试验 取高、中、低质量浓度对照品溶液,在1 d内于315.5 nm波长处测定吸光度5次,测得日内精密度 RSD分别为 0.54%、0.91%、1.8%,表明该方法精密度良好。

2.1.6 重复性试验 取同一脂质体6份,按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液,于315.5 nm波长处测定吸光度,测得黄芩苷含有量RSD为1.7%,表明该方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验 取同一脂质体,按 “2.1.2”项下方法制备供试品溶液,在0、1、2、4、6、8、10、12、14 h于315.5 nm波长处测定吸光度,测得其RSD为0.64%,表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密量取含有量已知的同一脂质体6份,精密加入对照品溶液,按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液,于315.5 nm波长处测定吸光度,计算回收率。结果,黄芩苷平均加样回收率为96.53%,RSD为2.5%。

2.1.4 线性关系考察 将对照品溶液用PBS稀释成 2.936、 5.872、 8.808、 11.74、 14.68、 26.402 μg/mL,于315.5 nm波长处测定吸光度。以黄芩苷质量浓度为横坐标 (X),吸光度为纵坐标 (A)进行回归,得方程为 A=0.040 1X+0.012 4(r=0.999 8), 在 2.936~26.402 μg/mL 范围内线性关系良好。

全区3.6万余亩樱桃中,“黑珍珠”品种达到近3.35万亩,玛瑙红和黄灯笼2个品种仅占约7%,品种过于单一。如遇樱桃褐斑病和根癌病等绝对优势病害爆发性发生,危害较重,很难有效及时地进行防治,易造成绝收和植株死亡,会给种植户带来极大损失[3]。另外,由于品种结构过于单一,导致成熟期集中,市场供应品种单一,加之樱桃果实不耐贮藏,且成熟期温度较高,采后处理设施滞后,如果成熟期遇雨,极易造成采前裂果、烂果和落果,产量损失严重。这都将给种植户销售樱桃带来巨大压力,也严重限制乌当樱桃走出去的步伐。

2.1.9.1 包封率 吸取适量脂质体,装进提前处理好的透析袋 (分子截留量10 000)中,浸入装有200 mL pH 7.0 PBS的烧杯中,120 r/min透析7 h,取透析介质,于315.5 nm波长处测定吸光度,计算游离黄芩苷含有量 (W游);另取适量脂质体,甲醇破乳后于315.5 nm波长处测定吸光度,计算黄芩苷总含有量 (W总),计算包封率,公式为包封率= (1-W游/W总) ×100%。

2.1.9.2 载药量 公式为载药量= [(W总-W游)/W]×100%,其中 W为卵磷脂、胆固醇、胆酸、黄芩苷总质量)。

2.2 制备方法

有希望才有失望,有要求才有不尽人意。父母希望孩子成龙成凤,这是压力,也是父母强烈的爱意与自信:我相信我的基因我的教育,我一丝不苟养育出来的孩子,必定会发挥我的最优面。亲戚也是,他们从小听惯“这孩子聪明”的话,信以为真,自动给这句话加了后半句“就是不用心/就是懒/就是没睡醒”——但还是认定“这孩子聪明”。他们相信响鼓也需重槌,对晚辈说几句重话,是为了让晚辈警醒。

2.1.3 供试品溶液制备 精密量取0.5 mL脂质体,甲醇破乳定容稀释,即得。

2.2.1 薄膜分散法[13]将处方量大豆卵磷脂、胆固醇、胆酸、黄芩苷加入24 mL三氯甲烷与乙醚(1∶2)混合液中,搅拌至完全溶解,置于梨形烧瓶中,20℃水浴下旋转蒸发除去有机溶剂,使类脂在瓶壁形成一层均匀的薄膜,脂膜中加入适量pH 7.0 PBS水化,水浴超声使其分散,0.22 μm微孔滤膜过滤3次,整粒减小粒径。

闹太套:是英语“not at all”的谐音。黄晓明在演唱歌曲《One World One Dream》时,由于对“not at all”的发音酷似“闹太套”而遭网友调侃。

2.2.3 泡腾分散法[14]将处方量黄芩苷、吐温80、卵磷脂、柠檬酸、胆酸溶于10 mL乙醇中,0.22 μm疏水膜过滤,5~8℃下将滤液加到10 mL 0.35%碳酸氢钠溶液中,1 000 r/min搅拌 1 h,25℃下继续搅拌,直至变得不透明。

2.2.4 方法筛选 表1显示,逆向蒸发法所得脂质体包封率、载药量较高,故选择该方法。

表1 制备方法筛选结果Tab.1 Results of preparation methods screening

2.3 制备工艺优化

2.3.1.2 胆酸用量 固定其他因素,选择胆酸用量 3、 5、 10、 15、 20、 30 mg, 按 “2.2.2” 项下方法制备脂质体。结果,胆酸用量10 mg时脂质体包封率、载药量较高。

2.3.1 单因素试验

2.3.1.1 胆酸加入顺序 固定其他因素不变,分别将胆酸加到有机相、水相、有机相与水相的混合相中,按 “2.2.2”项下方法制备脂质体。结果,胆酸加到混合相中时脂质体包封率、载药量较高。

为了充分了解大学生的综合素质状况,我们从某“211工程”高校所属的5个学院中抽了20名学生进行综合素质测评。各个指标值按照关键控制点的要求计算,获得的评价矩阵见表1。

2.3.1.3 磷脂-药物比例 固定其他因素,选择磷脂-药物比例 3 ∶1、 7 ∶1、 11 ∶1、 15 ∶1、 20 ∶1,按 “2.2.2”项下方法制备脂质体。结果,两者比例15∶1时脂质体包封率、载药量较高。

2.3.1.4 磷脂-胆固醇比例 固定其他因素,选择磷脂-胆固醇比例 2.5∶1、 3∶1、4∶1、5∶1、7∶1,按 “2.2.2”项下方法制备脂质体。结果,两者比例4∶1时脂质体包封率、载药量较高。

在上述实验基础上,通过仿真方法生成三通道SAR系统单个多普勒单元的512个距离门的杂波数据,并在其中添加3个动目标信号,分别位于第127,255,384距离门。随后,采用本文算法及原有SAR-STAP算法对数据进行处理,并在图7中给出了杂波抑制结果。此次仿真中,目标信噪比设为20 dB,其他参数同前,所有结果均为500次Monte-Carlo实验的平均值。

2.3.1.5 水化体积 固定其他因素,选择水化体积1、2、3、5、7 mL,按 “2.2.2” 项下方法制备脂质体。结果,水化体积1 mL时脂质体包封率、载药量较高。

2.3.2 Box-behnken设计 在单因素试验基础上,考察胆酸用量 (A)、磷脂-药物比例 (B)、磷脂-胆固醇比例 (C)对脂质体包封率 (Y1)、载药量(Y2)的影响,结果见表2。

由此可知,最优工艺为胆酸用量9.06 mg,磷脂-药物比例7.23∶1,磷脂-胆固醇比例4.55∶1。然后,按照优化工艺制备3批脂质体,测定其包封率、载药量,结果见表5,可知模型拟合度良好,可信度高。

表2 试验设计及结果Tab.2 Design and results of tests

然后,通过 Design-expert 8.04软件对表2数据进行拟合,得到方程分别为Y1=49.33-0.82A+1.77B+1.20C-1.49AB-0.43AC+0.94BC-5.13A2-4.79B2-1.96C2(R2=0.889 3)、 Y2=1.93-0.11A-2.28B+0.24C-0.070AB-0.015AC+0.023BC+0.081A2+1.56B2+0.14C2(R2=0.994 9), 方差分析表见表3~4。由表可知,模型具有显著性影响(P<0.05), 而失拟项不显著 (P>0.05); A2、 B2对包封率有显著影响 (P<0.05),而B、C、B2对载药量有显著影响 (P<0.05)。

表3 包封率方差分析Tab.3 Analysis of variance for encapsulation efficiency

响应面分析见图1,可知随着胆酸用量、磷脂-药物比例、磷脂-胆固醇比例增加,包封率均先增加后降低,可能与脂质体包载饱和程度有关。胆固醇在脂质体体系中起着 “流动缓冲剂”的作用,高于相变温度时可使脂质双分子层排列紧密,减少药物渗漏,从而增加包封率;但脂质体有一定包载程度,继续增加胆固醇用量时脂质双分子膜不对称性、膜通透性、刚性增加,导致药物渗透,包封率反而降低[15]。另外,磷脂-胆固醇比例增加可能在一定程度上提高药物包载率,即载药量有所增加。

表4 载药量方差分析Tab.4 Analysis of variance for drug loading

图1 包封率三维效应面图Fig.1 Three-dimensional effect surface diagrams of encapsulation efficiency

以《农村人民公社工作条例》的制定和修正过程为例。1961年3月22日,广州中央工作会议通过《农村人民公社工作条例(草案)》。紧接着,毛泽东要求把它放到群众中去征求意见以便修改。

2.2.2 逆向蒸发法[13]将处方量大豆卵磷脂和胆固醇加入24 mL三氯甲烷-乙醚 (1∶2)混合液中,搅拌至完全溶解,均匀加入适量黄芩苷PBS及胆酸,20℃水浴下超声10 min,形成稳定的W/O型白色乳剂,置于梨形烧瓶中,20℃水浴下旋转蒸发除去有机溶剂,形成可流动的胶态溶液,加入适量pH 7.0 PBS水化,继续旋转蒸发至形成淡黄色脂质体混悬液,将所得脂质体经0.22 μm微孔滤膜过滤3次,整粒减小粒径。

2.4 脂质体质量评价

2.4.1 外观 所得脂质体为淡黄色混悬液,4℃下放置几天后无分层现象。

表5 验证试验结果 (n=3)Tab.5 Results of verification tests(n=3)

2.4.2 物理稳定性 取6 mL脂质体,4℃下10 000 r/min离心15 min,未见明显分层现象,表明其物理稳定性良好。

总之,推进民生水利深入发展,重在深化认识,重在不断实践。应将民生理念贯穿于水利建设、管理、改革各个方面,体现在政策制定、工作部署、项目安排、业绩考核等各项工作中,把民生水利发展成效作为水利贯彻群众路线的重要标准,努力开创民生水利发展新局面。

2.4.3 透射电镜形态 取适量脂质体,pH 7.0 PBS稀释后,取适量滴加在铜网上,4 min后滴加1%磷钨酸溶液,染色30~60 s,自然干燥后在透射电镜下观察,结果如图2。由图可知,脂质体呈球形或类球形。

图2 脂质体透射电镜图Fig.2 Transmission electron micrograph image for liposomes

2.4.4 粒径、PDI、Zeta电位 取1 mL脂质体,20倍生理盐水稀释,测得其平均粒径 (图3)142 nm, PDI 0.190, Zeta电位-7.82 mV。

图3 脂质体粒径测定结果Fig.3 Results of particle size determination of liposomes

2.5 体外释放度 精密吸取相同浓度黄芩苷溶液、脂质体各3 mL,置于透析袋 (分子截留量10 000)中,两端扎紧,绑于桨上,置于200 mL pH 7.0 PBS中,37℃水浴100 r/min转速下动态透析,于0.5、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 8、 10 h吸取3 mL释放介质,补足同温3 mL PBS,于315.5 nm波长处测定透析介质中游离黄芩苷含有量,计算累积释放度Q[16],公式为 Q =C0V0+(C1+C2+C3+… +Cn-1)/m × 100% (Cn为第 n个取样点浓度, V0为释放介质体积,V为取样体积,m为原药量),再通过Origin 8.5软件绘制体外释药曲线,结果见图4。由图可知,黄芩苷溶液在6 h的累积释放率达到93.17%,而脂质体仅为57.83%。

文中充分利用Qt平台的优势,实现了ROV用户操作软件的设计;同时不再单纯考虑水下运动和实时监控功能,而是从多方面处理ROV的协作关系。虽然在细节方面仍有待完善,但是,通过泳池环境测试,验证了设计方案的可行性。

图4 样品体外释药曲线Fig.4 In vitro drug release curves for samples

黄芩苷在pH 7.0 PBS中溶解度最大[5],故选择其作为释放介质,同时满足体外释药一定的漏槽条件。脂质体体外释药过程分为突释、缓释2个阶段,前一阶段释放较快,主要来自未包封的游离药物;后一阶段释放较慢,主要是由于包封在脂质体中的药物需要跨越磷脂双分子层,从而起到缓释长效的作用。

然后,通过Origin 8.5软件对脂质体和黄芩苷溶液体外释放行为进行拟合[17],结果见表6。由表可知,两者均符合双相动力学模型。

表6 模型拟合结果Tab.6 Results of model fitting

3 讨论

3.1 制备方法筛选 泡腾分散法是指在制剂中加入碳酸盐与有机酸,遇水后产生CO2而调节释药行为的方法,其制备的脂质体粒径较小[13]。本实验在筛选胆酸-黄芩苷脂质体制备方法时发现,逆向蒸发法、泡腾分散法所得脂质体包封率均较高,但后者含有碳酸氢钠,胆酸可能与其发生反应而破坏自身结构,同时载药量也较低,故选择逆向蒸发法进行制备。

3.2 胆酸加入顺序及水化体积的影响 胆酸不易溶于水、乙醚、三氯甲烷中,单独加入水相或有机相中均难以溶解,故将其加入混合相中,并超声10 min乳化,同时包封率、载药量也有所增加,可能是由于胆酸具有表面活性剂作用。另外,水化时间太长会提高磷脂浓度,导致脂质体粒径增大,其聚集、絮凝几率也会上升,从而引起渗漏,稳定性降低。

3.3 “药辅合一”思想 “药辅合一”是中药制剂学中独特的用药理念,药物既具有一定药理活性,也可辅助其他药物或制剂,从而增强吸收、改变释放部位、协同增效减毒等[10]。胆酸是一种甾体化合物,在抗炎方面作用显著[18],可协同其他药物发挥协同增效作用[19],同时也能缓解毒性[20]。胆酸-黄芩苷脂质体中以黄芩苷为主药,胆酸为辅药,随着两者比例增加,脂质体抗炎作用、结肠炎靶向性也会随之提高,同时该制剂的成功制备也为后续炎症实验提供了基础。

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