芦思佳 陈丽荣

胸腺瘤（thymoma）是前纵隔发生于胸腺免疫器官中最常见的具有恶性倾向的肿瘤，每年在中国的发生率约0.17/10万[1]。胸腺瘤即使在完全手术切除后仍存在复发风险，复发率5%～50%，远处转移5%～21.2%[1-2]。目前关于胸腺瘤良恶性特征及复发的影响因素尚未开展广泛研究[1]。胸腺瘤的世界卫生组织（WHO）组织学分型一般被认为对胸腺瘤复发预测具有指导意义[2-3]，然而有研究发现WHO分型和胸腺瘤的预后转归并非呈完全的相关性[4]。近年来，部分免疫组织化学标记物被用于联合诊断胸腺瘤和各亚型的鉴别诊断[5-6]，提高了胸腺瘤的病理诊断准确性，如抑癌基因蛋白p53的表达水平和胸腺瘤的侵袭性行为密切相关[7]。细胞程序性死亡受体-1（programmed cell death 1，PD-1）及其配体1（PD-L1）是近年肿瘤免疫治疗研究的新热点[8-10]。PD-L1由肿瘤细胞表达，其通过抑制表达PD-1的T 细胞发挥免疫抑制和肿瘤保护作用，在肿瘤发生、免疫应答和预后结局中发挥重要作用[11]。胸腺瘤中PD-L1表达及其临床意义的研究较少，结果不一致。有研究发现胸腺瘤可显示高PD-L1表达，其表达可能与WHO分型及预后相关[12-14]；但也有研究表明胸腺癌的PD-L1阳性率并不比胸腺瘤高[8]。针对中国胸腺瘤人群的相关研究则更加匮乏。本研究旨在基于较大样本分析复发性胸腺瘤的PD-L1和p53免疫组织化学表型特征，并结合WHO组织学分型等临床指标与非复发性胸腺瘤进行比较分析，以阐明复发性胸腺瘤中促进肿瘤侵袭性生长和转移的相关性因素。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究为回顾性病例对照研究。查阅并统计2008年1月至2015年12月于浙江大学医学院附属第二医院行胸腺瘤完整切除术188例患者的病理资料，剔除失联79例、术后未定期复查2例、术后因胸腺瘤以外原因死亡3例。复发行多次手术病例选取首次手术标本纳入研究，其中行二次手术17例，行三次手术3例。最终纳入20例复发性胸腺瘤及61例未复发胸腺瘤，共81例，随访率49.09%。每例手术标本分型采用WHO分型标准[3]。

1.2 方法

免疫组织化学染色的组织切片厚度3～4 μm，70℃温箱烘烤30 min，常规脱蜡处理，pH 6.0 柠檬酸抗原修复液行抗原修复。免疫组织化学染色一抗室温孵育120 min。PV8000/HRP 二抗及显色系统室温下孵育20 min。DAB显色，苏木素复染。PD-L1为兔单克隆抗体（E1L3N，1:800，Cell Signaling Technology，美国），p53 为鼠单克隆抗体（DO7，1:400，北京中杉金桥生物技术有限公司）。PD-L1表达结果的评估由两位经过培训的病理医师计数肿瘤中两个代表性区域肿瘤细胞染色百分比（0～100%）和PD-L1强度（0～3：0，阴性；1，弱；2，中等；3，强），通过将染色的肿瘤细胞的百分比乘以染色强度来计算平均PD-L1表达评分（0～300）[15]，见图1。p53表达：所有标本均在3个代表性视野下计数染色阳性细胞数，见图2。＜10%细胞染色为阴性（-或0分），10%～24%为弱阳性（+或1分），25%～49%为中等阳性（++或2分），≥50%为强阳性（+++或3分）[7]。

1.3 统计学分析

使用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量资料以表示，组间年龄对比采用独立样本t检验。复发率用百分率表示，不同性别和WHO 分型之间的复发率比较采用χ2检验。复发组和未复发组WHO 分型及免疫组织化学标记物PD-L1 和p53 检测结果采用Mann-WhitneyU检验进行组间比较，采用Spearman等级相关系数进行相关性分析。不同WHO分型之间的PD-L1 和p53 检测结果比较采用Kruskal-WallisH检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

图1 免疫组织化学法检测胸腺瘤PD-L1表达（IHC×200）

图2 免疫组织化学法检测胸腺瘤p53表达（IHC×200）

2 结果

2.1 一般临床资料

20例复发性胸腺瘤中男性13例，女性7例；61例未复发胸腺瘤中男性27例，女性34例。男性患者复发率为32.50%（13/40例），女性患者复发率为17.07%（7/41例），差异无统计学意义（χ2检验，P=0.107）。在手术时点，复发组年龄36～73岁，平均年龄（55.85±12.11）岁，未复发组年龄29～76岁，平均年龄（57.21±10.00）岁，两组间差异无统计学意义（t检验，P=0.617）。复发组中，16例（80.00%）为局部复发，4例（20.00%）为远处转移。

2.2 WHO组织学分型

各分型在两组中的构成见图3。复发组20例中，A型0（0），AB型1例（5.00%），B1型4例（20.00%），B2型3例（15.00%），B3型8例（40.00%），C型4例（20.00%）。未复发组61例中，A 型13例（21.31%），AB 型10例（16.39%），B1型12例（19.67%），B2型13例（21.31%），B3型10例（16.39%），C型3例（4.92%）。两组间在WHO分型构成上差异有统计学意义（Mann-WhitneyU检验，P=0.001）。不同性别之间在WHO分型构成上差异无统计学意义（Mann-WhitneyU检验，P=0.359）。WHO分型与年龄无显著相关性（Spearman检验，P=0.246）。各类型的复发率见表1，其中A型复发率最低（0），C型复发率最高（57.14%），差异有统计学意义（χ2检验，P=0.017）。81例患者总体复发率24.69%。

图3 胸腺瘤复发组和未复发组的WHO分型构成

表1 81例胸腺瘤的WHO分型及复发情况例

2.3 免疫组织化学检测结果

复发组PD-L1分值和p53的等级较未复发组更高（Mann-WhitneyU检验，P=0.02和P=0.019，表2）。在所有标本中，PD-L1 分值和WHO 分型呈显著正相关（Spearman检验，r=0.358，P=0.001）；PD-L1分值和p53等级呈显著正相关（Spearman检验，r=0.317，P=0.004）。PD-L1和p53在不同WHO分型中检查结果的平均秩次见表3。两种免疫组织化学标记物在不同WHO分型中的平均秩次差异均有统计学意义（Kruskal-WallisH检验，PD-L1：P=0.013；p53：P＜0.001）。

表2 复发组和未复发组PD-L1和p53的平均秩次

表3 不同WHO分型中PD-L1和p53的平均秩次

3 讨论

根据国际胸腺恶性肿瘤研究小组（International Thymic Malignancy Interest Group）[3]的定义，胸腺瘤完整切除后位于局部（前纵隔）、区域（胸廓内但不与胸腺连接）和远处（肺内和胸腔外）的再发或转移均可定义为复发（recurrence）。绝大多数复发性胸腺瘤位于局部或胸廓区域内，少数病例发生远处转移，如肺、骨或肝脏[1]。目前被广泛接受的胸腺瘤复发影响因素主要为Masaoka 分期和WHO 分型，且这两个指标之间存在显著相关性[1]。研究表明大多数WHO分型A 型和B1 型胸腺瘤处于Masaoka Ⅰ期和Ⅱ期，而B2、B3、C 型大多处于Ⅲ期和Ⅳ期[16]。虽然之前关于WHO 分型是否具有预测预后价值的研究存在争议[17-18]，但最近一项长期大样本量（307例）的研究表明WHO分型和预后具有显著相关性[2]。本研究同样发现B3 型和C 型在复发组占比高于非复发组，而A型和AB型的复发率要低于其他亚型，因此本研究认为WHO 分型仍是一个可靠的预测胸腺瘤复发的指标。A 型和AB 型胸腺瘤以往被认为是“良性”肿瘤，但近年逐步认为这两型胸腺瘤具有潜在的低度恶性[19]。本组AB 型胸腺瘤复发1例，近年也有关于A型或AB型胸腺瘤可以发生远处转移的报道[20-21]。本研究发现B1型复发率较B2高，与既往研究不一致[2]，需要进一步积累大样本进行研究验证。

本研究发现，PD-L1 分值随着胸腺瘤WHO 分型等级由AB型至C型增高而增加，尤其在B3型和C型中显著升高，此结果与其他研究一致[8]。PD-L1在胸腺瘤复发组中显著高于未复发组，支持其是预测胸腺瘤恶性行为，如复发或转移的一个重要因素。有研究发现PD-L1的表达是预后差的独立危险因素[22]。因此，PD-L1表达可以为预测肿瘤预后提供参考，并可针对胸腺瘤的临床随访、选择治疗方法及免疫学靶向治疗提供依据。近年国际上已有Ⅰ、Ⅱ期临床试验报道PD-1/PD-L1 抑制剂对胸腺瘤的治疗作用[23-27]，显示其广阔的应用前景。本研究同时纳入各型胸腺瘤以及胸腺癌，发现PD-L1在各WHO分型之间的差异，有助于在将来指导临床利用PD-L1 分析进行胸腺瘤各个分型之间的鉴别诊断，尤其是胸腺瘤与胸腺癌之间的鉴别。有研究[13，28]表明，PD-L1表达和肿瘤预后的关系仍然存在争议，这可能与不同研究使用的抗体及其检测敏感性不同，以及各个研究的胸腺瘤构成情况不同相关。因此，胸腺瘤中PD-L1检测抗体、操作流程的标准化和结果判读标准等需要更多的研究进行探索。

以往研究发现，胸腺瘤p53的表达随着胸腺瘤WHO 分型等级的升高而逐步增加[29]，并且在复发性胸腺瘤中呈高表达[30]。Cornea 等[31]发现在1例复发性B1 型胸腺瘤中，免疫组织化学标记物高分子量细胞角蛋白（CK-HMW）、Ki-67、p53、Bcl-2、血管内皮生长因子（VEGF）和CD117 中仅p53 表达为阳性，提示其可能为预测复发的唯一指标，与本研究结果一致，即p53 等级在复发组高于未复发组，p53 等级和PD-L1 分值呈显著正相关。这些结果提示p53 可以预测胸腺瘤的复发，并且可能是除肿瘤WHO 分型之外的独立因素。由于本研究局限于回顾性设计，需要更多的前瞻性研究证实上述免疫组织化学标记物在不同类型胸腺瘤中与肿瘤预后的关系。

综上所述，WHO 分型及PD-L1 和p53 表达在复发性胸腺瘤和未复发胸腺瘤之间有显著性差异，本研究提示PD-L1 和p53 联合分析可以预测胸腺瘤复发的不良行为。