俞建顺 蔡丹莉 严茂祥 王小奇 桑怡 刘庆生*

作者单位：310021 杭州市丁桥医院（俞建顺）

310000 浙江省中医院（蔡丹莉 严茂祥）

310007 杭州市中医院（王小奇 桑怡 刘庆生）

胃癌是最常见的消化道肿瘤之一，严重威胁人类的生命健康。其发病率在全球高居男性肿瘤第4位，病死率排在第3位［1-2］。慢性萎缩性胃炎伴有肠上皮化生（Intestinalmetaplasia，IM）和异型增生（Dyspldsia，Dys）的病理状态称为胃癌前病，是从正常胃黏膜发展至胃癌的重要阶段。通过阻断胃癌前病变的进展可显著降低胃癌的发病率。因此，探索胃癌前病变的发生机制，具有重要的临床意义。研究发现，在胃癌前病变向胃癌的发展过程中，血管形成的程度逐渐加重，血管生成在胃癌发生的早期即已启动［3］。本文研究与血管生成密切相关的结缔组织生长因子（Connective tissue growth factor，CTGF）和内皮素 -1（Endothelin-1，ET-1）在胃癌前病变组织中表达的变化，探索其发病机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年SPF级SD大鼠36只，4～5周龄，雌雄比例2∶1，来自上海斯莱克实验动物有限公司。适应性喂养4周后至大鼠2+月龄，以2∶1配种，雌性大鼠怀孕后与雄性分开喂养，自由饮水和撮食，选择出生3d乳鼠进行实验。

1.2 主要试剂 1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（MNNG，Lot：ZZRRL-OR）购自东京化成工业株式会社，总RNA提取试剂盒（Lot：AK401）和RT试剂盒（Lot：AK3501）购自大连TaKaRa公司，CHamQTM SYBRR qPCR Master Mix（Lot：AK7803）购自南京诺唯赞生物科技有限公司，CTGF（B-6）鼠单克隆抗体（Lot：C0916）和 ET-1/2/3（H-38）鼠多克隆抗体（Lot：J1811）购自美国Santa Cruz公司，GAPDH鼠单克隆抗体（Lot：6153702）、Goat anti-mouse IgG（H+L）（Lot：5223340）购自杭州联科生物技术有限公司。总蛋白提取试剂盒（Lot：20160318）购自江苏凯基生物技术股份有限公司。引物由生工生物工程（上海）有限公司设计合成，CTGF上游引物5'-GAG TCG TCT CTG CAT GGT CA-3'，下游引物5'-GCA GCC AGA AAG CTC AAA CT-3'，扩增片段121bp，ET-1 上游引物5'-CTG GAC ATC ATC TGG GTC AA-3'，下游引物5'-CTG TTC CCT TGG TCT GTG GT-3'，扩增片段122bp；β-actin上游引物5'-TGT TGC CCT AGA CTT CGA GCA-3'，下游引物5'-CCA TAC CCA GGA AGG AAG GCT-3'，扩增片段155bp。

1.3 动物分组及处理 3d龄乳鼠共72只随机分为正常组和模型组，每组各36只，雌雄各半。乳鼠与母鼠同养，母乳喂养，模型组乳鼠每天禁食2h后以0.1ml MNNG（800mg/L）灌胃，正常组灌服等量生理盐水，连续10d。所有实验大鼠均3周龄断乳并分笼后采用全价颗粒饲料喂养，自由采食饮水。从MNNG灌胃结束后次日起计时，于实验第4周、16周、28周末禁食过夜后麻醉下每组分别处死大鼠12只，雌雄各半，取胃组织，沿大弯侧剖开，生理盐水冲洗，取胃窦至胃体小弯侧长条组织固定在10%中性福尔马林溶液中固定，剩余组织存入-75℃待用。

1.4 检测方法 大鼠胃黏膜组织病理学变化使用常规HE染色检测，诊断参考中国慢性胃炎共识（2012年，上海）和异型增生病变Pavoda国际分级标准。qRTPCR法检测雄性大鼠胃黏膜组织CTGF、ET-1 mRNA的表达：将大鼠胃黏膜内提取的总RNA通过反转录获得cDNA，随后进行PCR反应，结果以β-actin为内参，2-△△Ct表示各基因的相对表达量。Western blot检测雄性大鼠胃黏膜组织CTGF、ET1/2/3蛋白表达：胃黏膜蛋白通过电泳、转膜、一抗孵育（CTGF：1∶100；ET-1/2/3∶1∶200）、二抗孵育等步骤后化学发光检测，目标蛋白/GAPDH灰度值的比值即为各个蛋白的相对表达量。

1.5 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件包。计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析；计数资料采用非参数秩和检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌前病变形成过程中胃黏膜病理变化 HE染色光镜观察发现，不同时相点的正常组大鼠胃黏膜上皮细胞较完整，腺体排列规则而整齐，细胞核位于基底部呈椭圆形，可见少量淋巴细胞及浆细胞的浸润，有部分大鼠腺体数量轻度减少。造模组大鼠胃黏膜可见淋巴细胞和浆细胞的浸润，随造模时间增加而程度加重，但未见明显中性粒细胞浸润，模型组16周雄性大鼠、28周组胃黏膜慢性炎症程度较同期正常组明显增高（P＜0.05、P＜0.01）；造模组4周和16周时分别有1例和2例雄性大鼠胃黏膜固有腺体轻度萎缩，28周时所有大鼠出现不同程度萎缩，较同期正常组增高（P＜0.05）。模型组4周时大鼠腺体结构排列尚规则，16周时雄性大鼠2例出现非确定不典型增生，28周时腺体结构排列紊乱加重，大鼠出现不同程度不典型增生，以雄性较雌性明显，各大鼠均未见肠上皮化生，模型组28周胃黏膜典型增生程度较同期正常组明显增加（P＜0.05、P＜0.01）。见图 1。

图1 大鼠胃黏膜病理学变化（HE染色×100；A：正常组，B：模型4周组，C：模型16周组，D：模型28周组）

2.2 雄性大鼠胃黏膜CTGF及ET-1 mRNA表达的变化 在4周、16周和28周三个时相点，模型组雄性大鼠胃黏膜内CTGF及ET-1 mRNA的表达均较正常组有升高趋势。见图2。

图2 雄性大鼠胃黏膜CTGF、ET1mRNA表达的变化（x±s）

图3 雄性大鼠胃黏膜CTGF、ET-1/2/3蛋白表达的变化（s）；与正常组比较，⋆P＜0.05，#P＜0.01

图4 雄性大鼠胃黏膜CTGF、ET-1/2/3蛋白表达条带图

2.3 雄性大鼠胃黏膜CTGF及ET-1/2/3蛋白表达的变化 模型组雄性大鼠4周时胃黏膜CTGF蛋白表达较正常组显著降低，而在16周及28周较正常组升高，其中28周差异有统计学意义（P＜0.01）。在胃黏膜内ET-1/2/3蛋白的表达上，模型组雄性大鼠在4周和28周均较正常组大鼠升高，其中28周差异有统计学意义（P＜0.01），而在16周则较正常组有降低趋势。见图3、4。

3 讨论

血管生成是正常组织生长和分化过程中的基本过程，并且在多种人类疾病中扮演着关键的角色。过度的血管生成见于牛皮癣、关节炎、糖尿病视网膜病变和恶性肿瘤等疾病中。肿瘤相关的血管生成目前被认为是一种重要的治疗靶点。然而，关于血管生成和癌前病变之间联系的研究较少。关于血管生成和癌前病变之间存在联系最初的证据来源于对微血管密度（MVD）的研究。MVD被发现在鳞状细胞癌前病变中大范围增加，如口腔黏膜、皮肤、子宫颈、外阴和肛管中［4］。Tuccillo等［5］发现，幽门螺杆菌相关胃炎内存在血管内皮生长因子（VEGF）表达的增加，这一增加和胃黏膜内血管的形成的增加相关。而VEGF表达的增加同样存在于肠上皮化生和异型增生的胃黏膜腺体中，提示胃癌前病变同样存在血管生成的增加。

CTGF首先是作为血小板来源的生长因子相关丝裂原（人血管内皮细胞分泌）被发现的，一般由内皮细胞、成纤维细胞平滑肌细胞和成肌纤维细胞表达，一些上皮细胞也可表达［6］。CTGF和多种调节过程有关，如血管再生、软骨形成、骨发生、纤维化形成、糖尿病肾病和肿瘤形成等［7］。在不同的肿瘤组织中，其表达和肿瘤组织的生长和抑制均有关。在乳腺癌、胰腺癌、胃癌等肿瘤组织中，CTGF的表达和肿瘤的进展呈正相关，而在卵巢癌、结肠癌、软骨肉瘤、肺癌等肿瘤组织中则呈负相关。在胃癌患者体内，其表达和淋巴结转移、腹膜转移的程度呈正相关，而和生存时间呈负相关。CTGF参与癌细胞的浸润与转移、迁移、血管生成和失巢凋亡等过程。在低氧环境下，CTGF被激活并释放，通过调控VEGF诱导的血管生成，在肿瘤的形成与发展中起到了重要的作用。

ET是一种由21个氨基酸组成的内源性肽，包括ET-1、ET-2和ET-3三种亚型，是迄今为止最有效的血管收缩剂，并且和细胞增殖、迁移，血管生成和细胞凋亡有密切关系。ET-1是研究最为广泛的内皮素，是人类心血管系统内最丰富的类型。ET-1主要来源于血管内皮细胞，但也可由其他细胞生成，如肺、肾脏和结肠等器官的上皮细胞，巨噬细胞和单核细胞，周围肠神经胶质细胞和中枢神经系统的脉络丛和某些神经元以及反应性神经胶质细胞［8］。ET-1的表达在多种肿瘤中均有增加，包括肺、前列腺、结直肠、肝脏、乳腺和卵巢癌，这可能和其对细胞生长、转移和血管生成的促进作用和细胞凋亡的抑制作用有关。研究证明，低氧能够刺激内皮细胞合成ET-1［8-9］，而ET-1参与的血管生成在肿瘤的发生与发展中起到了重要作用。

本研究发现，胃癌前病变大鼠胃黏膜组织存在胃黏膜内皮细胞的损伤，血流减少导致局部的缺血、瘀血和水肿等，说明胃组织受损及继发炎症时，均伴随缺氧现象。随着造模时间的延长，大鼠逐渐出现胃癌前病变，胃黏膜内CTGF及ET mRNA的表达呈现逐渐上升的趋势，而尽管模型组大鼠在4周时CTGF蛋白的表达较正常组减少，在16周时ET-1/2/3蛋白的表达较正常组有减少趋势，但在造模28周时两者均较正常组显著升高。说明MNNG诱导的大鼠胃癌前病变的发生与发展伴随着CTGF和ET-1的表达的增加。造模早期两者的下降可能和机体的自我保护机制有关：通过减少两者的表达抵抗血管的发生，从而防止胃癌前病变的发生。

综上所述，低氧环境可诱导CTGF和ET-1的激活，从而促进血管的生成，这可能是胃癌前病变的发生和发展的机制之一，可为防止胃癌前病变提供新的思路。