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(1.湖南道县师范学校,湖南永州 425300; 2.北京化工大学生命科学与技术学院,北京 100029)

卵磷脂是动物和植物体内一种非常重要的含磷物质,主要包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇和磷脂酰丝氨酸等成分[1]。狭义而言,卵磷脂通常是指磷脂酰胆碱。磷脂酰胆碱由亲水性的头部和疏水性的尾部组成,是一种良好的食品乳化剂。研究表明,卵磷脂具有良好的生理特性,如抗氧化活性[2];提高大脑的活性和加强记忆力[3];降低血脂,减少脂质在血管内壁的停留时间,降低胆固醇[4]等。因此,卵磷脂在食品、化妆品以及医药等领域都有应用[5-6]。

卵磷脂来源十分广泛,如:蛋黄、牛奶、动物组织、大豆、玉米和油菜籽。目前,主要从大豆和蛋黄中提取卵磷脂,提取方法分为超临界CO2[7-8]和有机溶剂提取法[9-10]。上述方法均存在各自的优势和劣势,如超临界CO2萃取卵磷脂时,虽然可以避免高温和溶剂对产品特性的影响,但是设备昂贵,成本高;有机溶剂提取法成本相对较低,但是提取效率不高。超声提取法利用超声波的空化作用、机械效应和热效应等,加速胞内有效物质的释放、扩散和溶解,显著提高提取效率,广泛应用于卵磷脂的提取[11-13]。因此,耦合溶剂提取和超声提取的各自优势,采用超声辅助有机溶剂提取卵磷脂,将大幅提升提取效率,节约提取时间。

研究表明[14-15],超声辅助提取卵磷脂的主要影响因素包括:液料比、有机溶剂浓度和提取时间,因此,本文以蛋黄为原料,采用响应面方法,优化卵磷脂提取的上述3个主要影响因素,并采用薄层色谱、红外和气-质等,分析所获得的蛋黄卵磷酯结构特性和脂肪酸组成;同时,以大豆卵磷脂为参照,分析了蛋黄卵磷脂的稳定性和抗氧化活性,以期为蛋黄卵磷脂的综合利用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

脱油蛋黄粉 北京卵磷脂生物技术有限公司提供;磷脂酰胆碱标准品 Sigma公司;菜籽油和大豆油 北京华联超市;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(BHT)、无水乙醇、氯仿、甲醇、碘、氢氧化钾、三氟化硼乙醚、正己烷、氯化钠、氧化锌、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等 均为国产分析纯。

SB-5200超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司;UV-756CRT型紫外分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司;VERTEX 70v红外光谱仪 德国Bruker公司;Trace ISQ气相色谱质谱联用仪 Thermo Fisher公司;RE-52型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器有限公司。

1.2 蛋黄粉卵磷脂的提取与含量测定

1.2.1 超声辅助提取卵磷脂工艺流程

图1 卵磷脂提取工艺流程Fig.1 Process of lecithin extraction

1.2.2 工艺参数优化 研究表明,影响卵磷脂提取工艺参数,主要包括:液料比、乙醇浓度和提取时间[13-15]。为了获得最适提取工艺条件,采用响应面方法,以卵磷脂含量为指标,优化上述参数,因素水平表见表1。

表1 响应面实验设计因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.3 卵磷脂含量测定 采用钼蓝比色法(AOCS Official Method Ca 12-55)检测提取物中卵磷脂含量,用紫外分光光度计测定钼蓝的吸光度[16]。具体步骤:称取0.5 g卵磷脂提取物与坩埚中,加入0.5 g的氧化锌,于酒精灯上加热至全部炭化。再将其放入马弗炉中进行完全灰化,加入10 mL的1∶1盐酸溶液,加热到微沸,加热时间为5 min,然后将其过滤于50 mL锥形瓶中,用5 mL的热水冲洗坩埚3次,将洗液完全转移至锥形瓶中,加入50%氢氧化钾溶液中和至出现浑浊,再加入1∶1盐酸溶液使沉淀溶解,再加两滴。最后用水稀释至100 mL。取10 mL的待测液,加入8 mL的0.015%硫酸联氨溶液,2 mL 2.5%钼酸钠溶液。充分摇匀,放在沸水浴中加热10 min,然后冷却至室温。再加入5 mL的去离子水,静置10 min后,用分光光度计在650 nm处测定吸光度。对比磷脂酰胆碱标准曲线(y=0.475x+0.0016,R2=0.999),按以下公式计算卵磷脂含量。

卵磷脂含量计算公式:

C(mg/g)=(P/m)×(V1/V2)×26.31

式(1)

式中:C:卵磷脂含量,mg/g;P:标准曲线所对应的磷含量,mg;m:卵磷脂提取物样品的质量,g;V1:样品灰化后稀释的体积,mL;V2:检测时所取得待测液体的体积,mL。

1.3 蛋黄卵磷酯的结构特性

1.3.1 卵磷脂薄层色谱(TLC)分析 分别准确称取10 mg的磷脂酰胆碱标准品和卵磷脂提取物溶解在1 mL甲醇中,用毛细管将样品点样于25 mm×75 mm薄层板上,置于装有氯仿/甲醇/水(65∶25∶4,v/v/v)的层析缸内展开,用碘蒸气进行显色[17]。

1.3.2 卵磷脂红外光谱(FT-IR)分析 将卵磷脂提取物和磷脂酰胆碱标准品,分别和KBr进行压片制样,采用VERTEX 70v红外光谱仪进行测定。

1.3.3 气质联用(GC-MS)检测卵磷脂提取物脂肪酸组成 甲酯化:准确称取50 mg的卵磷脂提取物加入2 mL 0.5 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液,在60 ℃下反应30 min,加入2 mL的三氟化硼乙醚溶液反应20 min,冷却后加入2 mL的正己烷溶液,最后加入2 mL饱和氯化钠溶液。取上层正己烷相,加入少量无水硫酸钠,5000 r/min离心5 min,取上清过0.22 μm滤膜,进行GC-MS分析[18]。

分析条件:GC-MS:Trace ISQ气相色谱质谱联用仪,色谱柱:TG-WAXMS毛细柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。进样口温度为320 ℃,载气为氦气,流速为1 mL/min。升温程序:柱温50 ℃,保持1 min,25 ℃/min升温到200 ℃,3 ℃/min升温到230 ℃,保持15 min。离子源温度为280 ℃。电离方式EI,扫描模式为Scan,扫描范围为:35～550 amu。

1.4 蛋黄卵磷脂的稳定性与抗氧化研究

1.4.1 稳定性研究

1.4.1.1 温度对卵磷脂稳定性的影响 取适量蛋黄卵磷脂,在-4、4 ℃、室温(25 ℃)下进行密封避光贮藏,时间为15 d,测定酸值和抗氧化值。以磷脂酰胆碱标品作为对照。

酸值测定参照GB/T 5530-2005[19]。抗氧化测定参考文献[20]:取适量蛋黄卵磷脂和大豆卵磷脂用无水乙醇溶解,分别取1.5 mL加入到1.5 mL 0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液中,室温下反应30 min,在517 nm处用紫外分光光度计测定吸光度,计算清除率。

清除率(%)=(1-A1/A0)×100

式(2)

式中:A1:加提取液后DPPH溶液的吸光度;A0:空白对照DPPH溶液的吸光度。

1.4.1.2 光照对卵磷脂稳定性的影响 取适量的蛋黄卵磷脂和大豆卵磷脂,分别在光照和避光的条件下密封贮藏,温度为4 ℃,在第5、8、12 d时测定酸值和抗氧化值。酸值和抗氧化值测定方法同上。

1.4.2 抗氧化研究

1.4.2.1 卵磷脂对油脂的抗氧化分析 将5 mg/mL的蛋黄卵磷脂和大豆卵磷脂加入到大豆油和菜籽油中,进行加速氧化,温度为90 ℃,孵育5 h,测定大豆油和菜籽油的酸值和过氧化值。以相同浓度的抗坏血酸(VC)为阳性对照,以不加任何抗氧化剂,即空白实验作阴性对照。酸值测定参照GB/T 5530-2005[19]。过氧化值测定参照GB/T 5538-2005[21]。

1.4.2.2 卵磷脂还原力测定 分别取1、2、3、4、5 mg/mL的蛋黄卵磷脂和大豆卵磷脂溶液各0.5 mL,加入2.5 mL pH6.6磷酸缓冲溶液,0.5 mL去离子水,再加入1%铁氰化钾1 mL,混合物在50 ℃恒温条件下,加热20 min,急速冷却,加2.5 mL 10%三氯乙酸,3500 r/min离心分离10 min。取上层清液2.5 mL,加入2.5 mL去离子水,再加0.5 mL 0.1%三氯化铁,混合均匀,静置10 min后,以蒸馏水为参比在700 nm波长处测定吸光度[20]。

按照同样的操作步骤,以BHT为阳性对照,BHT的浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL。

1.5 数据分析

采用Design-Expert 8.0软件分析实验数据,每个实验平行重复3次,取平均值。

2 结果与讨论

2.1 响应面法优化蛋黄卵磷脂提取工艺

2.1.1 模型建立与显著性检验 根据Box-Behnken中心组合实验设计原理,采用Design-Expert 8.0软件,以液料比、乙醇浓度和提取时间为自变量,卵磷脂含量为响应值。按表1实验设计共进行17组实验,结果见表2。对表2数据进行多项式拟合回归,得到回归方程如下:

表2 卵磷脂提取工艺响应面实验及结果Table 2 RSM design and experimental results

Y(mg/g)=382.52-2.5X1+17.45X2+9.62X3+10.71X1X2-0.37X1X3-3.02X2X3-36.01X1X1-64.69X2X2-24.69X3X3

表3 回归模型方差分析结果Table 3 The main effective ANOVA

2.1.2 响应曲面分析与实验验证 不同因素对卵磷脂含量影响的响应面图和等高线图,见图2。从响应面的最高点可以看出,实验范围内存在极值。图2A表示了料液比和提取时间对蛋黄卵磷脂提取影响，响应面曲线走势陡峭，但是其等高线图近圆形，表明上述两因素交互影响相对来说显著性较弱。等高线图显示，料液比为15 mL/g，提取时间为25 min时，卵磷脂含量可达到最大值为382.52(mg/g)。图2B表示了乙醇浓度和提取时间对蛋黄卵磷脂提取影响，响应面曲线走势陡峭，等高线图为椭圆形状，表明上述两因素影响显著。等高线图显示，乙醇浓度为90%，提取时间为25 min时，卵磷脂含量可达到最大值为382.52(mg/g)。图2C表示了液料比和乙醇浓度交互作用对蛋黄卵磷脂提取影响，响应面曲线走势陡峭，等高线图为椭圆形状，表明上述两因素影响显著。等高线图显示，液料比15∶1 mL/g，乙醇浓度90%时，卵磷脂含量可以达到最大值382.52(mg/g)。

通过Design-expert 8.0软件,获得蛋黄卵磷脂提取的最佳工艺条件:液料比15 mL/g,乙醇浓度91.28%,提取时间22 min。在此工艺条件下,卵磷脂含量(Y)达378.47 mg/g。

为了检验响应面法所得结果的可靠性,同时考虑到实际操作和实验仪器的局限性，修正后的工艺条件如下：料液比为15∶1 mL/g,乙醇溶液为92%，提取时间为22 min。在此条件下进行了3次重复验证实验,得到卵磷脂含量的平均值为375.69 mg/g,与计算值误差0.73%,说明模型准确可靠,用于预测卵磷脂含量是可行的。

2.2 蛋黄卵磷脂结构分析

2.2.1 卵磷脂薄层色谱(TLC)分析 薄层色谱法检测了蛋黄卵磷脂提取物的组成,结果见图3。

图3 磷脂酰胆碱标准品和卵磷脂提取物的薄层色谱图Fig.3 Thin layer chromatography of phosphatidyl choline standard and lecithin extract 注:A. 磷脂酰胆碱标准品;B. 提取蛋黄卵磷脂。

从TLC图可以看出,卵磷脂提取物的斑点和磷脂酰胆碱标准品的斑点Rf值相同,由此可知,提取的蛋黄卵磷脂中含有磷脂酰胆碱。Gallier等[17]研究了四种牛奶乳制品的磷脂组成,TLC结果显示,四种乳制品中磷脂组成含有磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇和磷脂酸。因此,磷脂酰胆碱是卵磷脂主要组成成分之一。

2.2.2 卵磷脂红外光谱(FT-IR)分析 蛋黄卵磷脂提取物和磷脂酰胆碱标准品FT-IR分析结果见图4。它们具有相同的特征吸收峰:波数1089.5 cm-1左右的吸收峰为P-O-C的伸缩振动;波数967.1 cm-1的吸收峰为C-C-N弯曲振动;波数1236 cm-1的吸收峰为O-P-O伸缩振动;波数1738 cm-1的吸收峰是饱和脂肪酸羧酸酯中的C=O伸缩振动;波数2851和3008 cm-1的吸收峰分别为卵磷脂中饱和C-H和不饱和C=H伸缩振动。

图4 磷脂酰胆碱标准品和卵磷脂提取物的IR图谱Fig.4 The IR spectra of phosphatidyl choline standard and lecithin extract

2.2.3 蛋黄卵磷脂侧链脂肪酸组成GC-MS 分析 蛋黄卵磷脂提取物进行甲酯化处理,用GC-MS检测脂肪酸组成,结果见图5。可以看出,蛋黄卵磷脂中脂肪酸种类主要包括软脂酸(C16∶0)23.14%、硬脂酸(C18∶0)16.31%、油酸(C18∶1)25.35%、亚油酸(C18∶2)17.08%。饱和脂肪酸总含量为39%,不饱和脂肪酸总含量为42%。徐明明等[25]研究了蛋黄卵磷脂和蛋黄磷脂酰胆碱的脂肪酸组成与结构,结果表明,主要饱和脂肪酸组成为软脂酸和硬脂酸,不饱和脂肪酸为油酸和亚油酸,饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例约为1∶1,与本实验结果基本一致。

图5 卵磷脂的脂肪酸组成GC-MS分析Fig.5 Gas-chromatogram analysis of fatty acid composition of lecithin

2.3 蛋黄卵磷脂的稳定性研究

2.3.1 温度对卵磷脂稳定性的影响 以大豆卵磷脂为对照,探讨了温度对蛋黄卵磷脂稳定性的影响,结果见图6。随着温度的升高,酸值增加,清除DPPH的能力降低,表明温度与卵磷脂稳定性呈一定反比相关关系。从图中可以看出,蛋黄卵磷脂酸值升高程度和DPPH清除率降低程度要低于大豆卵磷脂,因此,蛋黄卵磷脂的温度稳定性优于大豆卵磷脂。Nara等[26]研究了大豆、蛋黄以及鲑鱼卵卵磷脂的氧化稳定性,证明蛋黄卵磷脂比大豆卵磷脂稳定性高,与本实验结果一致。产生这种现象的原因是蛋黄卵磷脂比大豆卵磷脂的饱和脂肪酸含量高,因此更稳定。

图6 温度对卵磷脂稳定性的影响 Fig.6 Effect of different temperature on lecithin stability

2.3.2 光照对卵磷脂稳定性的影响 以大豆卵磷脂为对照,研究了光照对蛋黄卵磷脂稳定性的影响,结果见图7。由图可知,在光照条件下,大豆卵磷脂和蛋黄卵磷脂的酸值都要比避光保存条件下高。大豆卵磷脂和蛋黄卵磷脂清除DPPH的能力会有所降低,表明光照对于卵磷脂稳定性有负相关影响。因此,贮存卵磷脂产品时,避光保存为宜。

图7 光照对卵磷脂稳定性的影响Fig.7 Effect of illumination on lecithin stability

2.4 卵磷脂抗氧化性分析

卵磷脂作为一种天然抗氧化剂,添加到食用油中可以有效防止油脂氧化。将大豆和蛋黄卵磷脂分别加入到大豆油(图A)和菜籽油(图B)中,以加入VC作阳性对照,以空白作阴性对照,进行加速氧化,检测食用油的氧化程度,可以间接说明卵磷脂的抗氧化性,结果见图8。

图8 卵磷脂抗氧化性分析Fig.8 Antioxidant activity of lecithin 注:A为大豆油体系;B为菜籽油体系。

实验表明,在大豆油和菜籽油中添加卵磷脂,表现出对食用油脂的抗氧化保护作用,这是因为卵磷脂易受到自由基的攻击而先被氧化,从而对油脂起到保护作用。其中,蛋黄卵磷脂的抗氧化效果好于大豆卵磷脂和VC。Palacios等[27]比较了蛋黄卵磷脂和大豆卵磷脂的抗氧化能力,结果显示,蛋黄卵磷脂要优于大豆卵磷脂,这与本实验结果一致。然而,随着氧化时间的延长,卵磷脂的抗氧化能力变弱,油脂酸值和过氧化值呈现增高趋势。Huang等[28]研究表明,VC和磷脂复配能增强磷脂的抗氧化效果。

2.5 卵磷脂还原力分析

研究表明,还原能力是反映抗氧化活性的一个重要指标。因此,通过测定还原力可以体现物质抗氧化能力的大小[29]。比较了蛋黄卵磷脂和大豆卵磷脂的还原力大小,以添加BHT作对照,结果见图9。

图9 卵磷脂还原力分析Fig.9 Reducing power of lecithin

实验表明,卵磷脂具有一定的还原能力,随卵磷脂质量浓度增加,蛋黄卵磷脂和大豆卵磷脂的还原力逐渐增强,且蛋黄卵磷脂的还原力高于大豆卵磷脂,这与它们的抗氧化实验结果是一致的。当蛋黄卵磷脂浓度为5 mg/mL时,在700 nm处的吸光值为0.213,但是,与BHT还原力相比,蛋黄卵磷脂的还原力明显较弱,约为BHT的十分之一。

3 结论

采用响应面法优化了超声辅助提取蛋黄卵磷脂工艺参数:液料比15∶1 mL/g、乙醇浓度92%、提取时间22 min。在此工艺条件下,卵磷脂含量378.47 mg/g。平行实验表明,响应回归模型计算值与实验值相近,验证了模型的可靠性。TLC和FT-IR分析表明,蛋黄卵磷脂提取物主要成分为磷酯酰胆碱。GC-MS分析了蛋黄卵磷脂脂肪酸组成,饱和与不饱和脂肪酸比例较接近于1∶1。稳定性和抗氧化分析表明,蛋黄卵磷脂具有一定的抗氧化性和稳定性,且优于大豆卵磷脂。高温和光照不利于蛋黄卵磷脂的贮藏。研究结果为蛋黄卵磷脂的加工和贮藏提供了一定的参考价值。