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(天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津 300457)

中国是禽蛋生产大国,目前国内市场上的蛋制品主要是全蛋粉、蛋清粉、蛋黄粉以及蛋液等低附加值产品。蛋白被认为是丰富的蛋白质具有丰富生物活性的多肽组分。蛋中含有人体必需氨基酸,蛋白质模型与人类蛋白质模型最为相似,蛋清中蛋白质含量约为11%～15%,主要包括卵清蛋白、卵转铁蛋白、溶菌酶、卵粘蛋白、卵清蛋白和抗生物素蛋白[1-3]。但目前禽蛋加工水平较低,原料生产较分散,禽蛋量虽然大,但是深加工产品较少,且加工技术落后,科技研发产品较少[4-5]。

生物活性肽基于固有的氨基酸组成和序列,通常含有2～20个氨基酸残基,是特定的蛋白质片段。生物活性肽在亲本蛋白质序列内无活性,可在蛋白水解或发酵过程中释放,并通过影响消化系统、内分泌系统、心血管系统、免疫系统和神经系统对人体健康产生重要作用[6]。从动物蛋白释放的几种肽已经被证实具有一系列的功能活性,包括血管紧张素转换酶抑制活性[7]、抗血栓形成[8]、抗高血压性[9]、抗氧化作用[10]、抗菌性、阿片样活性、细胞与免疫调节效应[11]、降胆固醇性质、抗肥胖和抗基因毒性等活性[12-14]。

目前,关于活性肽的分离纯化较多采用的是凝胶过滤层析、离子交换树脂、超滤、高效液相、电泳等方法[15]。各种分离技术在生产过程中协同发展、技术联用、取长补短、实行多级分离是生物活性肽分离纯化的发展趋势。其中超滤、离子交换层析、凝胶过滤层析由于其分离条件温和、产品回收率高、生物活性好、操作方便而广泛应用于多肽的分离纯化。如程云辉等[16]采用截留相对分子质量3 kDa的聚砜膜对麦胚蛋白酶解物进行了超滤分离,其抗氧化活性得到了显著提高。Ye等[17]以强阳离子交换填料为固定相分离小分子肽段,发现由2～8个氨基酸组成寡肽的分离峰峰形尖锐且分辨率很高。钟芳等[18]使用葡聚糖凝胶G-15纯化大豆蛋白源高活性酪蛋白血管紧张素转化酶抑制肽,其水解物的ACE抑制率从56.53%升至69.57%。

本研究以蛋清蛋白粉为原料,通过酶解法制备蛋清低聚肽,同时采用超滤、离子交换层析、凝胶层析常规方式对蛋清低聚肽进行分离纯化,同时采用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱对所得多肽进行结构鉴定,同时研究蛋清肽中抗氧化肽的活性及其结构,为蛋清肽的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蛋清蛋白粉 天津太阳食品有限公司;碱性蛋白酶(酶活102161.8 U/g) 山东欣鼎生物科技有限公司;001×7强酸性阳离子交换树脂 北京索莱宝科技有限公司;葡聚糖凝胶Sephadex G-25 北京索莱宝科技有限公司;氢氧化钠 分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;DPPH 分析纯,美国Sigma公司;磷酸二氢钠、磷酸氢二钠 分析纯,天津市风船化学试剂科技有限公司;龙胆酸2,5-二羟基苯甲酸 北京索莱宝科技有限公司。

DBS全自动部份收集器 上海生析超声仪器有限公司;752PC型紫外可见分光光度计 天津市普瑞斯仪器有限公司;MODEL808型酸度计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;Vizared 2.0型真空冷冻干燥机 美国VirTris公司;Autoflex speed基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱 沃特世科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋清肽的制备 用去离子水将蛋白粉配制成3%的蛋白溶液,95 ℃水浴锅下预热处理15 min,调制最适酶解温度57 ℃,保温处理10 min,将溶液调至最适pH8,加入4000 U/g碱性蛋白酶200 r/min恒温酶解,反应过程中,需不断加入1 mol/L的氢氧化钠保证pH恒定在8,酶解结束后95 ℃水浴灭酶处理15 min,冷却到室温4000 r/min离心15 min,上清液即为酶解液EWPH,真空冷冻干燥(0.37 Mpa,-80 ℃)12 h,冻干后置于干燥器备用[19]。

1.2.2 DPPH自由基清除能力测定 参考文献[20]方法并略作修改,配制蛋清肽浓度为2、4、6、8、10 mg/mL,分别取2 mL溶液加入0.1 mmol/L的DPPH溶液2 mL混合均匀,避光反应0.5 h,于517 nm处测定吸光度A1,分别测定等量溶液与等量无水乙醇、等量无水乙醇和等量等浓度DPPH混合溶液在相同条件下的吸光度A2、A3。DPPH自由基清除率计算公式如下:

1.2.3 膜超滤法分离纯化蛋清肽 采用截留分子量分别为10 kDa和3 kDa的超滤离心管，对经1.2.1制备的蛋清肽溶液进行分级分离(4000 r/min,15 min),所得各组分分子量大于10 kDa的EWPH-I,分子量约3～10 kDa的EWPH-II,及分子量小于3 kDa的EWPH-III。并将各组分于1.2.1相同条件下冻干并分析其DPPH自由基清除能力。

1.2.4 离子交换动态柱层析分离纯化 将超滤法分离所得的抗氧化活性最强的组分溶于pH6.0 0.05 mol/L的醋酸铵缓冲液，配制成浓度为20 mg/mL的溶液,利用相同醋酸铵缓冲液平衡001×7强酸性阳离子交换树脂装柱12 h。柱子平衡后,上样体积5 mL,吸附时间1 h,以0.2 mol/L氨水1.0 mL/min等速洗脱,并以3 mL/管收集洗脱液,于215 nm下检测吸光值[21],将属于同一峰的洗脱液收集在一起冷冻干燥,与1.2.1相同条件下冻干并分析其DPPH自由基清除能力。

1.2.5 凝胶层析法分离纯化 离子交换层析法分离所得的抗氧化活性最强的组分溶于pH7.0 0.02 mol/L磷酸盐缓冲液中配制成20 mg/mL的溶液。用相同缓冲液平衡Sephadex G-25葡聚糖凝胶树脂柱12 h。以下操作与1.2.4相同,将所得组分冻干并分析其DPPH自由基清除能力。

1.2.6 MALDI-TOF质谱分析抗氧化肽 将经两步纯化后的样品和基质龙胆酸2,5-二羟基苯甲酸(DHB)1∶1混合,取1 μL点在MALDI不锈钢靶板上,室温下自然干燥。另点1 μL DHB溶液(未点样品)作为空白对照。激光源为355 nm的Nd YAG激光器,加速电压为20 kV,采用正离子模式和自动获取数据的模式采集数据。

1.3 数据处理

采用Microsoft Office Excel 2007进行数据处理和分析,实验数据以3次重复的“均值±标准差”表示。采用SPSS 18.0软件进行实验数据的差异性分析,采用Origin 9.0绘制图像。

2 结果与分析

2.1 超滤纯化EWPH对其抗氧化活性影响

酶解液经超滤后,得到三个组分:EWPH-I(Mw>10 kDa)、EWPH-II(3 kDa

图1 蛋清蛋白肽不同超滤组分 对DPPH自由基的清除作用Fig.1 DPPH scavenging activity of different UF fractions of protein peptide注:误差线右侧不同小写字母表示差异性显著(p<0.05)。

2.2 离子交换层析分离纯化EWPH-III

图2 离子交换色谱分离EWPH-IIIFig.2 Separation of the EWPH-III by ion-exchange chromatography

组分馏分DPPH自由基清除率(%)A79.86±0.76aB82.05±1.21a

2.3 葡聚糖凝胶树脂分离纯化EWPH-III-B

如图3,得到C、D、E、F 4个组分峰,其DPPH自由基清除率分别为83.63%、85.26%、88.49%、87.62%(p<0.5)。其中EWPH-III-B-E组分DPPH自由基清除率能力最强,故将其最为进一步研究的对象。

图3 Sephadex G-25凝胶层析分离纯化EWPH-III-BFig.3 Separation of EWPH-III-B by Sephadex G-25 gel filtration chromatography

馏分DPPH自由基清除率(%)C83.63±1.22dD85.26±0.88cE88.49±0.74aF87.62±0.62b

2.4 MALDI-TOF/TOF-MS质谱分析抗氧化肽

采用MALDI-TOF/TOF-MS质谱分析抗氧化肽的质量指纹图谱和氨基酸序列,试验结果如下图4和图5所示。

图4 MALDI-TOF/TOF MS一级谱图Fig.4 MALDI-TOF/TOF MS spectrum

图4中测得值为母离子,从各母离子中选择丰度值最高的母离子进行MS/MS序列分析。图中709.060的峰为EWPH-III-B-E组分的质子化分子([M+H]+),即相对分子质量为709.060。从MALDI-TOF/TOF-MS谱图上则能清楚看到依旧存在m/z 165.012、332.760、823.745、868.716、1181.032等的杂肽。因此将709.060 Da的离子作为母离子,进一步进行TOF-MS/MS二级质谱分析,结果如图5所示。MS/MS图谱中低质荷比的亚氨离子揭示了肽段的氨基酸组成。在二级质谱图中有一个很强的信号峰即为237.575分子离子峰([M+H]+),通过软件计算和分析,得出EWPH-III-B-E组分的氨基酸序列为丙氨酸-甲硫氨酸。

图5 m/z709.06的MS/MS图谱Fig.5 MS/MS spectrum of component at m/z 709.06

3 结论

本研究通过超滤、离子交换色谱、及凝胶过滤色谱分离技术,以肽组分的分子量大小、抗氧化等性质的不同对蛋清蛋白酶解物(EWPH)进行逐级纯化。超滤法分离纯化EWPH所得的三个组分中,EWPH-Ⅲ(MW<3 kDa)组分的DPPH自由基清除率最高,达到79.62%。离子交换层析分离纯化EWPH-III所得到2组分中,其中酸性组分A的DPPH自由基清除率为79.86%,碱性组分B的DPPH自由基清除率为82.05%。通过凝胶过滤色谱分离EWPH-III-B所得到4组分中,C组分的DPPH自由基清除率为83.63%,D组分的DPPH自由基清除率为85.26%,E组分的DPPH自由基清除率为88.49%,F组分的DPPH自由基清除率为87.62%,其中EWPH-III-B-E组分抗氧化活性最强。最后通过MALDI-TOF/TOF-MS质谱分析抗氧化肽EWPH-III-B-E组分的质量指纹图谱和氨基酸序列得到其氨基酸序列为丙氨酸-甲硫氨酸,目标抗氧化肽的功能因子组成为二肽。本研究明确了蛋清蛋白抗氧化肽的抗氧化活性,并对其含有的抗氧化肽进行了分离和结构鉴定,为蛋清蛋白抗氧化肽的开发和利用提供了理论基础和实验依据。