冯媛

北京市化工职业病防治院呼吸科，北京 100093

尘肺是指生产性粉尘在肺组织内潴留引起的肺组织弥漫性纤维化[1]。尘肺一旦发生不可逆转，且易引起肺结核、支气管炎及肺癌等病变[2-3]。尘肺病变的发生发展是一个渐进过程，从开始接尘到发现临床尘肺，一般要十数年或更长的时间。且该病并无特异临床表现，主要有咳痰、呼吸困难等呼吸道症状，在早期尘肺中上述表现不明显[4]。因此，寻找一种可用于尘肺患者早期诊断的特异性指标极为必要。miRNA被证实与多种脏器的纤维化进程紧密相关[5-6]。本次研究观察尘肺患者血清miRNA表达水平变化情况，筛选尘肺早期筛查指标，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2014年7月至2018年3月收治的160例尘肺患者进行研究，按病程分为I期组与II期组，均符合《GBZ 70-2009尘肺病诊断标准》中尘肺病诊断标准[7]。另抽取80例男性健康体检者作为对照组，对照组入组者无粉尘接触史、无重要脏器器质性病变。所有研究对象入组前均签署知情同意书，自愿参与研究。三组研究对象一般资料比较差异无统计学意义，可比性良好，见表1。

1.2 研究方案

每人抽取5 mL外周静脉血，提取血清并置于EP管中，零下80℃条件下保存，采用QiaGen miReasy Mini Kit试剂盒提取总RNA，总RNA提取成功后保存于零下80℃。随机抽取6例尘肺患者及6例健康体检者血清样本，采用TaqMan Human MicroRNA Array Set v2.0低密度芯片对667个已知的miRNA进行筛选，尔后采用实时荧光定量-聚合酶链反应技术对低密度芯片筛选出的miRNA进行验证。操作均按试剂盒说明书进行。

1.3 观察指标

miRNA表达水平：采用实时荧光定量-聚合酶链反应技术检测，以相对定量法评估miRNA表达水平，选择cel-miR-39作为外参，样本ΔCt（达到阈值的循环数）=CtmiR—Ctcel-miR-39，ΔCt越低表明miRNA表达水平越高。结果分析采用SDS2.4与RQ Manager1.2 软件。

miRNA标志物筛选标准：I期组及II期组合并为尘肺组，ΔΔCt=尘肺组ΔCt—对照组ΔCt，ΔΔCt=绝对组≥2的miRNA纳入筛查范围，进行验证。最终共纳入10个miRNAs，如表2所示。

表2 miRNAs验证指标（x±s）

1.4 统计学分析

对本临床研究的所有数据采用SPSS18.0进行分析，计数资料以（n/%）表示，并采用χ2检验，计量资料以（x±s）表示，多组比较采用F检验，差异有统计学意义的指标组间两两比较采用LSD-t检验，相关性采用Spearman相关性分析，P＜0.05时差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA水平变化情况比较

将10个ΔΔCt≥2的miRNAs纳入验证，其水平变化情况如表3所示。方差分析提示miR-200c、miR-16、miR-21、miR-206、miR-204、miR-29a及miR-155表达水平比较差异有统计学意义，组间比较发现I期组及II期组miR-21、miR-200c、miR-16、miR-206、miR-29a及miR-155表达水平均高于对照组，而miR-204表达水平低于对照组，其中I期组miR-21表达水平低于II期组，而miR-204表达水平高于II期组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表3 miRNAs水平变化情况比较（ΔCt，x±s）

2.2 miRNA水平与病程相关性分析

Spearman相关性分析发现，miR-21与病程进展正相关(rs=0.682)，miR-204与病程进展负相关(rs=-0.713)，相关关系均有统计学意义(P＜0.001)。

3 讨论

尘肺对个人和社会均可造成较大负担和损失，人均年社会生产力损失高达60.85万元[8-9]。因此，尽早明确诊断并早期进行干预具有重要意义。目前在《GBZ 70-2009尘肺病诊断标准》中仍以胸部X线影像作为诊断尘肺病的主要手段。但胸部X线片需要肺组织发生纤维化后才能发现病变，且不同水平的医师读片结果差异较大[10-11]。CT、MRI等影像学手段在尘肺的诊断中也有一定应用，但分别因费用高、对肺纤维化敏感性低等原因限制了其应用价值[12-13]。近年来较多研究对早期诊断生物标志物进行探索，集中在微量元素、血清蛋白、氧化剂与抗氧化剂、细胞因子与凋亡相关因子等方面，但都存在敏感性与特异性低的特点，尚未取得突破性进展[14]。而BALF检查与肺活检具有侵入性，临床应用有较大限制。因此，寻找一种生物标志物用于尘肺早期诊断具有重大的应用价值及社会效益。

miRNA是一种内源性非编码小RNA，参与细胞分化、增殖、凋亡等过程，在多种疾病的进展中起着重要调节作用[15]。近年来研究发现miRNA在血清中的形态非常稳定，可避免被内源性核酸核糖酶降解[16]。同时，miRNA在酸碱异常、温度异常及反复冻融条件下均能保持温度，具有作为生物学指标的优势[17]。miRNA与肺组织纤维化紧密相关。有研究对慢性阻塞性肺疾病患者484个miRNA表达水平进行检测，发现其中150个miRNA表达水平下调2-3倍[18]。还有研究发现miRNA-155表达水平与小鼠肺组织纤维化程度正相关[19]。Sun等[20]的研究也发现小鼠肺纤维化模型中miR-21等多个miRNA表达异常。还有研究证实miR-149 的多态性与尘肺易感性相关[21]。肺组织纤维化是尘肺的主要病理基础，miRNA可能与尘肺进展有关[22]。

本次研究首先采用Taq低密度芯片对667个已知的miRNA进行筛选，尔后采用实时荧光定量-聚合酶链反应技术对筛选出的miRNA进行验证，结果发现 miR-200c、miR-16、miR-21、miR-206、miR-204、miR-29a及miR-155等7个miRNA表达水平表达异常。进一步分析发现I期组及II期组miR-21、miR-200c、miR-16、miR-206、miR-29a及miR-155表达水平均高于对照组，而miR-204表达水平低于对照组，其中I期组miR-21表达水平低于II期组，而miR-204表达水平高于II期组，差异均有统计学意义。

刘理静等[23]的研究发现，肺纤维化患者miR-21表达水平增高，而降低其表达水平后肺纤维化严重程度随之下降。miR-155主要通过促进白介素-8分泌加重肺纤维化程度。肿瘤生长因子β1是促纤维化因子，其表达水平增高可抑制miR-29a的表达[24]。miR-200c的表达水平也与肿瘤生长因子β1有关，调节其表达水平可在一定程度上改善肺纤维化程度[25]。miR-206、miR-16与miR-204被证实可通过促进成纤维细胞增殖及细胞外基质聚集[26]。miRNA主要通过抑制或降解靶mRNA发挥作用，本次研究结果表明以上7个miRNA可能通过影响相应的靶miRNA参与尘肺的发生发展。Spearman相关性分析发现，miR-21与病程进展正相关(rs=0.682)，miR-204与病程进展负相关(rs=-0.713)，表明这两个miRNA可能作用于影响病情进展的mRNA，进而影响尘肺病情的进展，但其具体作用机制有待下一步研究。

总 之，miR-200c、miR-16、miR-21、miR-206、miR-204、miR-29a及miR-155等miRNA在尘肺患者血清中表达水平异常，其中miR-21与miR-204在不同病程时表达水平差异较大，可为尘肺患者早期筛查提供新的思路。