朱 雯，马煜明，曾 莉，胡 斌，刘亚楠，周立亭，陈明珠

（1.华中农业大学 园艺林学学院，湖北 武汉 430070；2.浙江茗皇天然食品开发股份有限公司，浙江 龙游 324400；3.武夷学院 茶与食品学院，福建 武夷山 354300）

甜茶(Rubus chingiivar.suavissimus)属蔷薇科悬钩子属植物，主要分布于广西、云南、四川和湖南等地，因其叶味甜而常做茶饮，故称“甜茶”[1]。甜茶是天然的药食兼用植物，具有无糖自然甜的特性，非常适合糖尿病病人饮用，同时还具有生津润肺、止咳化痰、抗衰老、消炎等功效[2]。金花菌作为茯砖茶“发花”和形成其特征品质的优势菌种，已得到广泛的关注和研究。有研究表明，金花菌发酵过程中可引起发酵原料的内含物质的变化，还能产生丰富的次生代谢产物，改善发酵原料的品质[3]，提高发酵原料的功效[4]。为此，本试验利用金花菌人工接种发酵甜茶，分析金花菌对发酵甜茶生化品质和抗氧化活性的影响，研究结果为金花菌发酵甜茶的生化基础和特色甜茶产品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

实验菌种为华中农业大学茶学系茶叶生物加工与技术课题组从茯砖茶中筛选出优势金花菌。甜茶原料为广西甜茶。试剂购于国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 金花甜茶的制备

孢子悬浮液制备： 刮取PDA（Potato Dextrose Agar）平板上培养约一周的金花菌接入无菌水中（每2个平板接入30 mL 无菌水），置于离心机中3000 r/min 条件下离心5 min，上清液即为孢子悬浮液。

金花菌发酵甜茶：取20 g 甜茶装入发酵罐中，121℃灭菌21 min，冷却后每瓶接种1 mL金花菌悬浮液，加入无菌水至含水量为40%。置于28℃恒温培养，4 d 后取出置于烘箱中，在40℃条件下干燥120 min 左右，至手揉可成粉末、含水量为4%～6%即可。同时，以甜茶不接种金花菌悬浮液，加入等量无菌水进行发酵，作为金花甜茶对照（ck）。

1.2.2 生化成分测定

游离氨基酸含量测定：茚三酮比色法；可溶性糖含量测定：蒽酮比色法；水浸出物含量测定：恒重法；茶多酚含量测定：GB/T 8313-2008 Folin-酚试剂法；黄酮含量测定：SZDB/Z 349-2019 食品中总黄酮的测定 分光光度法。

1.2.3 抗氧化活性测定

茶汤提取：称取1.5 g 茶粉，加入20 mL 蒸馏水于90℃水浴锅中水浴30 min，每10 min 摇一次。提取后冷却，4200 r/min 下离心15 min，取上清液加蒸馏水定容到25 mL 容量瓶。

清除羟自由基活性测定方法：取10 mL 离心管→加入1 mL 4 mmoL/L 水杨酸-无水乙醇 →1 mL 4 mmol/L FeSO4溶液→1 mL样品液→1 mL 4 mmol/L H2O2→37 ℃温度水浴30 min →3600 r/min 离心5 min 待测→510 nm 波长下（以蒸馏水作为参比液）测定样品组吸光值Ax、模型对照组A0（样品空白）和样品对照组AX0（试剂空白）。清除率S（%）=[1-（Ax-AX0）/A0]×100[5]。

总抗氧化能力测定方法（FRAP 法）：取3 mL FRAP 至5 mL 离心管中→37 ℃水浴中预热10 min →加入0.1 mL 待测液→反应30 min →取出冷却至室温（以蒸馏水作对照，于595 nm 处测定吸光值A）。以硫酸亚铁为标准溶液0.2～2 mmol 的FeSO4的标准溶液代替样品绘制标准曲线，将OD值代入标准曲线，计算相当于硫酸亚铁的量。标准曲线：C=0.4026*A+0.008 R2=0.9993（C表示相当于硫酸亚铁的浓度，单位g/L）。计算1 g 茶相当于硫酸亚铁的mg 量，单位mg/g：M=C*25*d/m*m0(d 稀释倍数，m 称取茶叶的重量，m0茶叶的干物质重）[6]。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除活性测定方法：取2 mL 茶汤于试管中→加入2 mL 新鲜配制的0.15 mmol DPPH 溶液→混合均匀→室温遮光反应30 min→517 nm处（以95%乙醇作为参比液）测定吸光值样品组Ax、模型对照组A0（样品空白）和样品对照组AX0（试剂空白）。清除率S（%）=[1-（Ax-Ax0）/A0]×100[7]。

1.3 数据处理

数据经Excel 和SPSS 13.0 处理，大写字母和小写字母分别表示Duncan’s 新复极差(SSR)在p＜0.01 和p＜0.05 水平下的差异显著性，字母不同表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 金花菌发酵甜茶中游离氨基酸、可溶性糖与水浸出物的含量

甜茶经过人工接种发酵后，游离氨基酸含量与原料和ck 相比都有显著性差异，分别降低了37.2%和37.6%；可溶性糖含量与原料和ck相比也都有显著性差异，分别降低了13.9%和15.9%。接种金花菌后的甜茶的水浸出物对比甜茶原料并没有显著性差异，但是ck 对比甜茶原料水浸出物降低了4.8%。傅冬和等人研究茯砖茶加工过程中化学成分变化，其中氨基酸含量下降36.84%，可溶性糖和水浸出物含量没有明显变化[8]。虞飞人工接种金花菌发酵茶，发酵过程中氨基酸和水浸出物含量随时间的增加不断减少，但可溶性糖的含量则呈现出先增加后减少的趋势[9]。接种金花菌后，金花菌在甜茶表面生长消耗部分甜茶本身的营养物质，这可能是接种金花菌后游离氨基酸含量与可溶性糖含量都显著降低的原因。

2.2 金花菌发酵甜茶中茶多酚与黄酮含量

甜茶经过人工接种金花菌发酵后，对比原料，茶多酚含量和黄酮含量显著增加，增加幅度分别达到33.6%和11.0%，但对比ck，茶多酚含量和黄酮含量均没有显著性差异。有研究结果表明，微生物发酵过程中茶叶中多酚类物质在微生物外源酶的作用下被降解，大分子的儿茶素聚合体也被降解为小分子物质，最终导致茶多酚总含量呈现下降趋势。薛志强等人利用从普洱茶中分离的顶头孢霉进行罐装发酵普洱茶的试验时也出现对照组和试验组黄酮类含量随着发酵时间的延长持续上升，但对照组与试验组并不存在显著差异的现象[10]。秦俊哲等人通过人工接种金花菌发酵茯砖茶，发花过程中茶多酚含量持续降低，最后加工为成品茶时茶多酚含量呈现回升[11]。本试验中甜茶发酵后茶多酚含量增加可能是由于高温灭菌或者发酵过程中的湿热反应导致甜茶内含物质变化，甜茶色泽变化进而影响分光光度计测试时的吸光值，出现相对于未发酵原料来说含量增加的反常情况。

表1 不同处理甜茶内含成分（g/kg）Table 1 The components of sweet tea with different treatment（g/kg）

图1 不同处理甜茶的抗氧化活性Fig.1 The anti-oxidative activities of sweet tea with different treatment

2.3 金花菌发酵甜茶的抗氧化能力

2.3.1 清除羟自由基活性

清除羟自由基活性方面，甜茶原料经过高温灭菌加水发酵处理后，清除羟自由基活性显著降低，IC50值降低至2.09 g/L，相比于甜茶原料降低率达40.6%；而加入金花菌发酵的实验组与原料相比也显著降低，IC50值降低至2.39 g/L，降低率达32.1%。金花菌发酵甜茶与ck 清除羟自由基活性没有显著性差异。本试验中可能由于高温灭菌导致甜茶中的某些抗氧化活性物质的急剧降低，使得ck 与实验组中的抗羟自由基活性显著性降低。

2.3.2 总抗氧化活性

以RFAP 清除活性法分析不同处理甜茶的总抗氧化性时，与甜茶原料相比，ck 和金花菌发酵甜茶总抗氧化活性都显著升高，分别升高了107.3%和46.1%。高温灭菌以及发酵过程中的某些变化都可能导致处理后甜茶的总抗氧化活性显著性提升[11]。李磊研究发现茶多酚的RFAP抗氧化活性随着EGCG 浓度的升高而增加[12]。贾学静等人测定老鹰茶总黄酮抗氧化活性，成熟叶老鹰茶质量浓度20 g/L 时，DPPH 自由基清除率66.66%，RFAP值相当于2.05 mmol/L FeSO4，并呈一定的量效关系[13]。而本试验中总抗氧化活性显著升高可能与金花菌发酵甜茶中茶多酚和黄酮类物质含量增加有关。

2.3.3 DPPH 自由基清除活性

DPPH 自由基清除活性方面，与甜茶原料相比，ck 和金花菌发酵甜茶DPPH 自由基清除活性显著性降低，分别降低了28.4%和29.3%。分析原因可能与清除羟自由基活性差异原因一致。李玉婷等人对金花菌黄色素进行研究，结果表明，低浓度黄色素具有明显高于维生素E (VE)的还原能力、DPPH 自由基清除率和溶血抑制率，其中DPPH 自由基的IC50 低于50 mg/L[14]。欧阳梅[15]等人人工接种冠突散囊菌发酵茶叶并测定发酵茶抗氧化活性，结果表明，发酵茶对DPPH 和ABTS 两种自由基的清除能力分别达到75%和56%以上，而对DPPH 的清除能力略低于对照，与本试验结果一致。虽然金花菌本身产生的次生代谢物质具有清除DPPH 自由基的能力，但是发酵过程中金花菌对于原料本身内含物质的改变情况并不明确，因此并不能判断金花菌发酵茶叶一定会提高茶叶的DPPH 自由基清除活性。

3 讨论

3.1 接种金花菌发酵对内含成分的影响

通过外源性添加安全可控的微生物不仅会对茶叶的内含物质成分产生影响，更会对茶叶的风味进行深刻地改变，形成独特的香气滋味等。杨久玲[16]等通过接种可以产生酱香风味的微生物发酵红茶，对照茶样与酱香风味茶样比较，两者的游离氨基酸含量差异显著，茶多酚等差异不显著，酱香风味红茶中的部分游离氨基酸是发酵液中加入的。谭雪[17]等利用金花菌发酵夏秋鲜叶发现，接种金花菌会提升游离氨基酸含量与可溶性糖含量，水浸出物含量会随着发酵过程逐渐降低。本试验中甜茶经过人工接种发酵金花菌后，其游离氨基酸含量与可溶性糖含量显著下降，茶多酚含量与黄酮含量显著升高，而对水浸出物含量无显著性影响。

3.2 接种金花菌发酵对抗氧化活性的影响

本试验结果表明，甜茶经过人工接种金花菌发酵后，总抗氧化活性显著提高，羟基自由基清除活性和DPPH 自由基清除活性显著降低。潘慧敏[18]等通过对7种广西产甜茶抗氧化活性的比较，藤茶具有很好的清除DPPH 自由基的能力。王婉莹[19]等通过建立了藤茶UPLCDAD 指纹图谱，对藤茶DPPH 自由基清除活性的谱效关系进行了研究，结果表明双氢杨梅素是藤茶清除DPPH 自由基活性的最大贡献成分；并对藤茶的抗氧化活性的日常冲泡工艺进行优化，结果表明l g 藤茶加56 mL (80℃)的水，冲泡5.8 min 时，藤茶DPPH 自由基的清除率可达86.49%。