赵兴丽，卯婷婷，张金峰，孟泽洪，李 帅，周玉锋*

（1.贵州省农业科学院 农业生物技术重点实验室，贵州 贵阳 550006；2.贵州省农业科学院 植物保护研究所，贵州 贵阳 550006；3.贵州省农业科学院 茶叶研究所，贵州 贵阳 550006）

土壤是茶树营养吸收和生长发育的重要场所，是茶叶生产的基础，土壤质量的好坏直接或间接影响茶叶品质与产量。根际土壤与植物联系最为密切，根际土壤内生存的微生物是根际微生态的重要组成部分[1]，是土壤生态系统的主要参与者，能够有效调控土壤根际环境和促进养分的转化，进而影响土壤物理结构和土壤肥力[2]。近年来，由于化肥和农药长期过量施用，导致土壤生态环境不断恶化，致土壤板结、微生物种群结构趋劣等[3]，从而间接或直接引发茶树自身抗逆性降低、病虫害多发以及茶叶品质下降等一系列问题[4]。有研究发现，提高作物生物群落多样性，可促进作物根际土壤有益菌的生长、增强植株自身的抗逆性，从而抑制土传病害传播[5]；而季节[6]、海拔[7]以及种植年限[8-9]等都会影响作物根际土壤微生物多样性及其群落结构特征。此外，不同品种的同一作物，根际土壤微生物群落组成和结构也会存在一定的差异性。刘凤红[10]研究表明，蓝莓根系内生真菌的群落组成和结构因其品种的不同而存在一定差异，且各菌属在不同品种蓝莓根系内的优势度也不同。李强[11]等通过Biolog 方法比较了不同烤烟品种之间根际土壤微生物群落结构及多样性差异，结果表明，不同品种烤烟根际微生物种类和优势种群数量并无差异，但微生物种群的分布情况存在显著差异。目前，有关不同品种茶树根际土壤微生物多样性的研究鲜见报道。本研究通过 Illumina MiSeq 高通量测序技术，对4个茶树品种的根际土壤真菌多样性及丰度进行比对，旨在明确不同茶树品种根际土壤的优势菌群及对茶树的影响，为茶园的生态管理提供参考与指导。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验地为贵州省遵义市道真仡佬族苗族自治县（107°62′E，28°93′N），位于云贵高原向四川盆地过渡的斜坡地带，属于亚热带湿润季风气候，年平均气温8.0℃～16.4℃、降雨量800～1400 mm、海拔884～939 m、日照时数1076 h。土样采集区茶树为试验园长势相仿的4个茶树品种：中白1号（BC）、黄金茶（HJC）、黄金芽（HJY）和中茶108（ZC108），树龄分别为5年、8年、5年、5年，行距均为1.5 m。该地地形属岗坡地，黏质土。

1.2 研究方法

1.2.1 土壤取样

土样采集时间为2018年8月8日，采用五点取样法用铁锹分别采集中白1号、黄金茶、黄金芽、中茶108 的根际土壤，每个品种各取6份，采集土样混匀后，去除土壤中残留的根系及其他杂质后装入无菌样品袋中，低温保存。

1.2.2 土壤pH值及含水率的测定

土壤pH值与含水率的测定参照张艳艳等[12]的方法，土壤经0.165 mm 过筛后，按G 土∶V水=1.0 g ∶2.5 mL 的比例充分混匀后，以pH计测定土壤pH值，重复3 次。分别称取10 g土壤于60℃烘箱中进行烘干处理，烘干后测定其干重。

1.2.3 土壤真菌总DNA 提取、ITS 基因扩增及上机测序

将每个土样经2 mm 过筛充分混合后，提取基因组DNA，并采用通用引物对 ITS1F（5′-CTT GGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GC TGCGTTCTTCATCGATGC-3′）对真菌ITS 基因ITS1 区进行测序[13-14]。PCR 扩增ITS 特异性片段试验采用Ta Ka Ra r Taq DNA Polymerase，反应体系（20 μL）：10× Buffer 2 μL、2.5 mMdNTPs 2 μL、Forward Primer（5 μM) 0.8 μL、Reverse Primer（5 μM）0.8 μL、r Taq Polymerase 0.2 μL、BSA 0.2 μL、Template DNA10 ng、ddH2O 13 μL。反应程序：95℃预变性3 min、95℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s、25个循环、72℃延伸10 min、10℃保存∝，PCR 产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测质量后，上机检测（依托上海美吉生物医药科技有限公司完成）。

1.3 数据处理

数据采用DPS 7.05 软件进行差异性分析，差异显著性检验采用Duncan 新复极差法。

2 结果与分析

2.1 土壤pH值及含水率

结果表明，4个茶树品种根际土壤的pH值和含水量无显著差异（表1）。

2.2 高通量测序及数据分析

2.2.1 根际土壤稀释曲线

从图1 可以看出，样品稀释曲线基本上趋于平缓，多样性指数表可以看出文库的覆盖率（Coverage）达90%（表2），二者共同说明该土壤样品OTU 覆盖度基本饱和，可以反映该区域真菌群落的种类和结构。通过高通量测序，4个茶树品种根际土壤的12个样品共获得656918条有效序列，总碱基数达153727532 bp，平均长度为234 bp。

表1 不同品种茶树根际土壤pH值及含水率Table 1 PH value and moisture content of rhizosphere soil of different varieties of tea plant

图1 不同土壤样品的稀释曲线Fig.1 Dilution curves of different each soil samples

2.2.2 茶树根际真菌的多样性指数

Alpha 多样性指数一般包括Shannon 丰富度指数、Simpson 优势度指数、ACE 指数及Chao1指数，其中Shannon 丰富度指数代表群落物种多样性，Simpson 优势度指数代表常见物种，Chao1 指数和ACE 指数代表群落物种丰富度；数值越大，说明菌群多样性或丰度越高。表2结果表明，除Simpson 优势度指数无明显变化以外，其他指数均表现为显著性差异（P＞0.05）。中白1号、黄金芽、黄金茶、中茶108 的根际土壤微生物ACE 指数分别为241.56、238.55、281.50 和228.00。从Shannon 指数分析，黄金茶的根际土壤真菌物种丰富度较高（3.22），其次为中茶108（2.54）和中白1号（2.46），黄金芽的根际土壤真菌物种丰富度最低（1.03）。从Chao1 指数来看，黄金茶显著高于其他三个品种。以上表明，4个茶树品种中，黄金茶根际土壤真菌群落的多样性和丰富度最高。

2.2.3 茶树根际真菌群落结构组成及多样性

中白1号、黄金芽、黄金茶和中茶108 等4个茶树品种根际土壤分别含有6、4、5 和 4个门类的真菌群。4个茶树品种根际土壤菌群中丰度最高的3 大主要门类相同（图2），均为担子菌门（Basidiomycota）、子囊菌门（Ascomycota）以及接合菌门（Zygomycota），它们在4个茶树品种根际土壤中均有分布，但在不同品种茶树根际土壤所占比例不同。从表3 可以看出，本试验中的中白1号和黄金茶的根际土壤真菌优势门类为子囊菌门（Ascomycota），分别占总序列的60.31%和70.31%；黄金芽的根际土壤真菌优势门类为担子菌门（Basidiomycota），占总序列的86.78 %；中茶108 的根际土壤真菌优势门类为担子菌门（Basidiomycota）、子囊菌门（Ascomycota）和接合菌门（Zygomycota），分别占总序列的38.25%、28.73%和26.39%，与其他三个品种茶树相比，中茶108 的根际土壤中未检测出罗兹菌门（Rozellomycota）。

由图2 及表3 对比发现，4个品种茶树根际土壤中担子菌门（Basidiomycota）的相对丰富度为黄金芽＞中茶108 ＞黄金茶＞中白1号，子囊菌门（Ascomycota）的相对丰富度为黄金茶＞中白1号＞中茶108 ＞黄金芽，接合菌门（Zygomycota）的相对丰富度为中白1号＞中茶108 ＞黄金茶＞黄金芽。

表2 不同品种茶树根际土壤真菌丰富度指数与多样性指数Table 2 Diversity and richness index of the rhizosphere soil fungus of different varieties of tea plant

表3 茶树根际土壤真菌群落在门水平上的组成和含量（%）Table 3 Composition and content of Fungi community in rhizosphere soil of tea plant at the phylum level（%）

图2 在门分类水平的茶树根际土壤真菌组成聚类堆积图Fig.2 Cluster stacking graph of composition of Fungi in rhizosphere soil of tea plant at phylum level

从属分类水平来看，中白1号、黄金芽、黄金茶以及中茶108 等4个品种茶树根际土壤分别含有17、20、19 及17个属类菌群。柱状图（图3）结果表明，不同品种茶树根际土壤真菌群落在属水平优势物种和相对丰度都有所不同。结合表4 可以看出，本试验中黄金芽的根际土壤真菌优势属类为隐球菌属（Cryptococcusspp.），其占了总序列的79.82%；中白1号的根际土壤真菌优势属类为隐球菌属（Cryptococcusspp.）和被孢霉属（Mortiellaspp.），分别占了总序列的27.72%和24.02%；黄金茶的根际土壤真菌优势属类为镰孢菌属（Fusarium spp.）和被孢霉属（Mortiellaspp.），分别占了总序列的18.27%和12.61%；中茶108 的根际土壤真菌优势属类为隐球菌属（Cryptococcusspp.）和被孢霉属（Mortiellaspp.），分别占了总序列的31.39%和24.76%。

从图3 及表4 可以看出，在属水平中白1号和中茶108 的根际土壤真菌的相对丰度具有较高的同源性。4个品种茶树的根际土壤中隐球菌属（Cryptococcusspp.）的相对丰富度为黄金芽＞中茶108 ＞中白1号＞黄金茶，被孢霉属（Mortiellaspp.）的相对丰富度为中茶108 ＞中白1号＞黄金茶＞黄金芽，镰孢菌属（Fusarium spp.）的相对丰富度为黄金茶＞中白1号＞黄金芽＞中茶108，假霉样真菌属（Pseudallescheriaspp.）的相对丰富度为中白1号＞中茶108 ＞黄金芽＞黄金茶。

2.2.4 茶树根际真菌群落结构的差异性

图3 在属分类水平的茶树根际土壤真菌组成聚类堆积图Fig.3 Cluster stacking graph of composition of Fungi in rhizosphere soil of tea plant at genus level

表4 土壤部分真菌群落在属水平上的组成和含量（%）Table 4 Composition and content of the part of fungus communitiesy in soil at genus level（%）

图4 不同茶树根际土壤样品OTU 分布的Venn 图Fig.4 Venn diagrams of OTU distribution of the rhizosphere soil samples of different varieties of tea plant

利用Venn 图对4种茶树根际土壤样品的OTU 分布进行分析，结果见图4。4个品种茶树的根际土壤样品中均有分布的OTU 数量为196，共有OTU 数量最多的是中白1号和黄金茶（455），最少是黄金芽和中茶108（300）；茶树根际土壤样品中共有最多的组合是中白1号、黄金芽和黄金茶（298），说明这3个品种茶树的根际土壤真菌群落组成具有较高的同源性；4个品种茶树的根际土壤样品中独有OTU数从大到小依次为黄金茶（200）、中茶108（187）、中白1号（117）和黄金芽（61）。

从属水平上对4个品种茶树的根际土壤样品所含真菌菌属进行Heatmap 分析，结果表明，假霉样真菌属（Pseudallescheriaspp.）在黄金芽、中茶108 和中白1号的根际土壤真菌群落中丰度较高，而黄金茶根际土壤真菌群落中丰度最高的为镰孢属（Fusarum spp.）（图5）。

图5 在属分类水平的茶树根际土壤样品OTU 分布的Heatmap 分析Fig.5 Heatmap analysis of OTU Distribution of the rhizosphere soil samples at genus level

3 讨论

3.1 不同品种茶树根际土壤真菌多样性和丰富度具有一定的差异性

多样性指数与微生物群落多样性呈正相关，多样性指数越高微生物群落多样性越丰富。试验结果表明，不同品种茶树的根际土壤的OTU数量和群落多样性指数Shannon 都表现为黄金茶＞中茶108 ＞中白1号＞黄金芽，群落丰富度指数Chao1 和ACE 表现为黄金茶＞中白1号＞黄金芽＞中茶108。结果表明：①不同品种茶树的根际土壤真菌群落多样性和丰富度表现出一定的差异性；②黄金茶根际土壤真菌多样性最为丰富，但因其种植年限高于其他3个品种，故该品种根际土壤真菌多样性较丰富的具体原因有待进一步研究。

3.2 不同品种茶树根际土壤真菌群落结构具有一定的差异性

本试验结果表明，该地区茶树根际土壤真菌群落共划分为4个已知的菌门，其中，担子菌门（Basidiomycota）、子囊菌门（Ascomycota）和接合菌门（Zygomycota）为优势真菌群，担子菌门为第一优势门。从属的分类水平来看，黄金芽的根际土壤真菌优势属类为隐球菌属（Cryptococcusspp.），中白1号根际土壤真菌优势属类为隐球菌属（Cryptococcusspp.）、被孢霉属（Mortiellaspp.）和假霉样真菌属（Pseudallescheriaspp.），黄金茶根际土壤真菌优势属类为镰孢菌属（Fusariumspp.）和被孢霉属（Mortiellaspp.），中茶108 的根际土壤真菌优势属类为隐球菌属（Cryptococcusspp.）和被孢霉属（Mortiellaspp.）。结果表明：①黄金芽的根际土壤优势真菌种类单一，中白1号、黄金茶和中茶108 的根际土壤优势真菌种类较丰富；②大部分土壤真菌都能够在茶树根际定殖，但不同品种茶树根际土壤定殖真菌各有不同，表明茶树品种对其根际土壤真菌群落结构有一定的影响。