赵伟进，张格杰，王孝先，刘晓凤，卢玉君，何建清

(1.西藏农牧学院植物科学学院，西藏 林芝 860000；2.西藏农牧学院食品科学学院；西藏 林芝 860000)

青稞，即裸大麦(Hordeumvulgare)，是藏族人民的主粮，其中黑青稞含有多种有益人体健康的矿物质元素及含有独特的花青素类物质，是西藏重要的特色资源并倍受关注，同时黑青稞生产对维护西藏地区粮食安全、社会稳定和积极推动西藏地区经济发展具有积极作用[1].刘国一等[2]研究表明氮素是西藏一江两河地区青稞生长及产量的限制因子[2]；但是过量施用氮肥所带来的生态环境问题也日趋显著[3]，而现在相关研究表明利用固氮细菌在禾本科作物根部的固氮作用，在一定程度上可减少化学肥料的使用[4-5].联合固氮细菌是具有固氮能力的一类植物根际促生菌，近年来，植物根际联合固氮研究受到了极大关注，且研究表明，在小麦、燕麦、玉米、青稞等禾本科植物根际均存在着联合固氮作用，并在田间试验取得较好的成果[4-6].随着人们对微生物肥料的促生作用和无公害农业产品的日益重视，联合固氮菌肥越来越受到人们的青睐[7].本研究旨在利用制作联合固氮菌肥，测定其对黑青稞生长及产量的影响，为联合固氮菌肥在西藏地区应用和推广提供理论和实践依据.

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验在西藏农牧学院实习农场进行.试验点平均海拔2 990 m，年平均气温8.8 ℃，年降水量650～700 mm，年日照2 022 h，无霜期180 d，土壤为砂壤土[8].试验有机质含量为19.10 g/kg、全磷含量为2.3 g/kg、有效磷4.02 mg/kg、碱解氮132.5 mg/kg、土壤pH为5.85.

1.2 菌株和菌肥制作

试验用菌株是从西藏山南隆孜县黑青稞根际筛选的优良的功能菌株，固氮菌菌株HQ3-3、HQ3-5和HQ7-4有效的氮含量分别为116.02、120.82、112.20 mg/L.将筛选的固氮菌株分别接种在LB培养基中，置于28 ℃，160 r/min培养7 d后，利用紫外分光光度计测定各菌株发酵液D值.当D660值大于0.5即发酵菌液中的细胞数目≥10×108个/mL时，用灭菌水将各发酵菌液调至相同的光密度值(OD660=0.7)，备用[9].

菌肥载体：将腐质土干燥、粉碎，过筛(0.15 mm)，按照腐殖土与珍珠岩1∶1混合，调pH值至7.0将其在121 ℃下间歇灭菌3 h后分装成500 g小袋.

在菌肥载体上分别接种上述制作的固氮菌株发酵液150 mL，将菌液与菌肥载体充分混匀后置于30 ℃培养14 d后常温保存[9].

1.3 试验设计

固氮菌肥肥效试验设3个处理：对照(CK)，菌肥载体(腐殖土与珍珠岩1∶1)处理(CK1)，全量氮肥(CN)，固氮菌肥(BN)，试验设计详见如表1.播种前以磷肥(过磷酸钙)及尿素(150 kg/hm2)作基肥施入.供试青稞为西藏山南隆孜县六棱黑青稞，种子发芽率为85%.试验前用上述制作的菌肥拌黑青稞种子4～5 h后播种，菌肥用量按照与种子重量的1∶1进行条播，行距25 cm.小区面积2.5 m×1.2 m，埂宽30 cm，随机区组设计[10].

1.4 测定指标及方法

菌肥质量检测采用稀释平板计数法和观察法[11]，于青稞不同生育时期(苗期、抽穗期、灌浆期、成熟期)测定植株自然高度，每小区随机取10株，求平均值；拔节期、抽穗期在每小区随机取10株，用排水法测量根体积；主根长度采用每样地随机取10株求平均值的方法；成熟时各小区单独收获，测定各小区籽粒产量[9].

用半微量凯氏定氮法测定拔节期、抽穗期地上部粗蛋白含量及籽粒粗蛋白含量[12]，采用钼锑抗比色法测定有效磷含量[13]，采用聚酯纤维滤网袋法测定青稞秸秆纤维素含量[14]，火焰原子吸收法测定青稞秸秆及青稞籽粒K及Zn含量[15]，用残余法测定青稞籽粒粗脂肪的含量[16].

1.5 数据处理

试验数据用 Excel 2016软件处理，SPSS 24.0统计软件做方差分析，Origin 2018软件作图.

表1 各处理化肥用量及菌肥施用方案

2 结果与分析

2.1 固氮菌肥检测

将本研究制作的3种固氮菌肥BN-1、BN-2及BN-3于室温下储存，菌肥经30、60、120 d制作的3种联合固氮菌肥其有效固氮菌数量均在5.00×108个/g以上，但180 d时3种联合固氮菌肥其有效固氮菌数量为低于5.00×108个/g，如表2所示，无杂菌污染.

表2 固氮菌肥的质量检查结果

“+”表示污染；“-”表示无污染.

‘+’means contaminated；‘-’means uncontaminated.

2.2 固氮菌肥对青稞株高的影响

如图1所示，在苗期，固氮菌肥BN-3处理下的青稞株高与氮肥(CN)处理无显著差异，与基质对照(CK1)、空白对照(CK)差异显著(P<0.05)，促进作用明显，与空白对照(CK)相比增加14.23%.在拔节期，BN-2和BN-3菌肥处理的株高与基质对照(CK1)、空白对照(CK)差异显著(P<0.05)，与空白对照(CK)相比分别增加了44.59%、39.72%.在抽穗期，BN-2菌肥处理的株高与基质对照(CK1)、空白对照(CK)差异显著(P<0.05)，与空白对照(CK)相比增加了4.88%.在成熟期，BN-2和BN-3菌肥处理的株高与基质对照(CK1)、空白对照(CK)差异显著(P<0.05)，与空白对照(CK)相比分别增加了18.02%、7.98%.在拔节、抽穗及成熟期氮肥(CN)处理与3种菌肥处理差异显著(P<0.05)，与基质对照(CK1)、空白对照(CK)亦有显著差异(P<0.05)，与空白对照(CK)相比分别增加49.50%、10.39%、21.94%.菌肥BN-2处理下拔节、抽穗及成熟期的株高效果接近全氮(CN)处理.

不同小字母表示处理间差异显著(P<0.05).Different lowercase letters indicate significant differences in different (P<0.05).图1 不同施肥处理对青稞株高的影响Figure 1 Effects of the fertilization on plant height of black highland barley

综上所述，固氮菌肥对株高的促进作用主要表现在苗期，在拔节、抽穗及成熟期菌肥对株高促进效果增幅较小，整体效果不及氮肥(CN)的处理.

2.3 固氮菌肥对青稞主根长度及根体积影响

从主根长度看(表3)，固氮菌肥处理(BN-1、BN-2和BN-3)在生育期拔节期和抽穗期内虽表现出了一定的促进效果，与氮肥(CN)、基质对照(CK1)和空白对照(CK)差异显著(P<0.05)，拔节期与抽穗期固氮菌肥处理与CK相比增加幅度分别为14.26%～17.50%、12.46%～19.47%.

从根体积来看(表3)，拔节期和抽穗期菌肥BN-1和BN-3表现出较好的促生效果，与氮肥(CN)无显著性差异，与基质对照(CK1)和空白对照(CK)相比有显著差异(P<0.05).

2.4 固氮菌肥对青稞秸秆的影响

2.4.1 固氮菌肥对青稞秸秆粗蛋白、P及K含量的影响 由表4可知，拔节期BN-2、BN-3及CN处理下的黑青稞秸秆粗蛋白含量分别比对照(CK)增加21.89%、28.93%、14.29%，差异显著(P<0.05).抽穗期固氮菌肥及CN施肥处理下粗蛋白含量均低于空白对照(CK)，其中菌肥BN-1、BN-2和BN-3与CN处理差异显著(P<0.05).拔节期菌肥BN-2处理下的钾含量与空白(CK)相对比无显著差异(P<0.05)，其他施肥处理下钾含量均比对照(CK)低；抽穗期各施肥处理钾含量均低于对照(CK)，且差异显著(P<0.05).拔节期菌肥BN-2及BN-3处理下，磷含量均高于对照(CK)且差异显著；抽穗期各施肥处理磷含量均低于对照(CK)且差异显著(P<0.05).菌肥BN-2处理下拔节期和抽穗期的青稞秸秆促进K、P和N的吸收.

表3 不同施肥处理对青稞主根长度及根体积的影响

同列不同小字母表示差异显著(P<0.05).

Different small letters in the same column indicate significant differences(P<0.05).

表4 不同施肥处理对黑青稞秸秆粗蛋白、P及K含量的影响

同列不同小字母表示差异显著(P<0.05).

Different small letters in the same column indicate significant differences(P<0.05).

2.4.2 固氮菌肥对青稞秸秆纤维素的影响 由图2可知拔节期与抽穗期黑青稞的中性洗涤纤维(NDF)含量显著高于酸性洗涤纤维 (ADF).拔节期各施肥处理下中性洗涤纤维(NDF)含量均显著低于对照(CK)(P<0.05)；但固氮菌肥(BN-1、BN-2和BN-3)处理下中性洗涤纤维(NDF)含量均显著高于CN处理(P<0.05).抽穗期固氮菌肥(BN-1、BN-2和BN-3)及CN处理下的中性洗涤纤维(NDF)含量均低于对照(CK)差异显著，但固氮菌肥(BN-1、BN-2和BN-3)处理下中性洗涤纤维(NDF)含量均高于CN处理，差异显著(P<0.05).

黑青稞秸秆酸性洗涤纤维(ADF)含量(图2)拔节期CN处理下的含量最高，同时固氮菌肥BN-1、BN-2及BN-3含量均低于对照(CK)差异显著.抽穗期BN-1、BN-2和BN-3处理下酸性洗涤纤维(ADF)含量均高于对照(CK)，相对于对照(CK)含量分别增加7.62%、1.94%、6.58%，差异显著(P<0.05).

图2 不同施肥处理对黑青稞秸秆纤维素的影响Figure 2 Effects of the fertilization on neutral detergent fibre,acid detergent fibre and hemicellulose of black highland barley

在拔节期及抽穗期固氮菌肥及CN处理下黑青稞秸秆半纤维素含量均低于对照(CK)，差异显著(P<0.05)，但拔节期固氮菌肥(BN-1、BN-2和BN-3)处理下半纤维素含量均高于CN处理，显著差异；抽穗期BN-1、BN-2处理下半纤维素含量与CN处理无显著差异.固氮菌肥(BN-1、BN-2和BN-3)处理下拔节期到抽穗期中性洗涤纤维 (NDF)含量呈递减趋势，酸性洗涤纤维 (ADF)呈递增趋势.

2.5 固氮菌肥对青稞籽粒的影响

2.5.1 固氮菌肥对青稞籽粒粗蛋白、粗脂肪、P、K及Zn含量的影响 由表5可知，3种菌肥中菌肥BN-2促进K、P、Zn的在青稞籽粒中的积累，菌肥BN-3促进氮元素的积累，菌肥BN-1促进粗脂肪的积累.固氮菌肥BN-1、BN-2和BN-3处理下的黑青稞籽粒粗蛋白含量均低于对照(CK)，差异显著(P<0.05).CN施肥处理下粗蛋白含量最高，比空白对照(CK)含量增加31.63%，差异显著(P<0.05).从钾含量百分比中看(表5)，菌肥BN-2及CN处理下籽粒的钾百分含量与空白(CK)相对比差异显著(P<0.05)，相比对照(CK)分别增加6.67%、4.76%.表6表明，菌肥BN-2及CN处理下，籽粒磷含量均高于对照(CK)，差异显著，相比对照(CK)分别增加10.48%、7.73%.固氮菌肥BN-1、BN-2和BN-3处理下的籽粒锌含量高于对照(CK)，与对照(CK)相比分别增加了20.27%、53.65%、2.89%.籽粒粗脂肪含量(表5)除菌肥BN-1处理，其他施肥处理下的粗脂肪含量均低于对照(CK)，差异显著.菌肥BN-1处理的籽粒粗脂肪含量比对照(CK)增加16.26%.

表5 不同施肥处理对黑青稞籽粒粗蛋白、粗脂肪、P、K及Zn含量的影响

同列不同小字母表示差异显著(P<0.05).

Different small letters in the same column indicate differences significant ficant(P<0.05).

2.5.2 固氮菌肥对青稞籽粒产量的影响 从籽粒千粒重上看(表6)，固氮菌肥(BN-1、BN-2和BN-3)处理与氮肥(CN)处理无显著差异(P>0.05)，与基质对照(CK1)和空白对照(CK)相比均有显著增加(P<0.05).从籽粒产量上看(表6)，各施肥处理比对照均有显著增加，籽粒产量CN>BN-3>BN-2>BN-3>CK1>CK，其中以CN的产量最高；而3种菌肥中以BN-3的产量为最高.

表6 不同施肥处理对黑青稞籽粒产量的影响

同列不同小字母表示差异显著(P<0.05).

Different small letters in the same column indicate significant differences(P<0.05).

3 讨论

本研究的施用菌肥BN-3与空白对照(CK)相比在拔节、抽穗及成熟期黑青稞的株高分别增加了44.59%、4.88%、18.02%；CN处理下与空白对照(CK)相比分别增加49.50%、10.39%、21.94%.拔节、抽穗及成熟期菌肥BN-3处理下的黑青稞株高接近全氮(CN)处理.菌肥BN-1处理下促进黑青稞地下部分生长.这张堃等[7]、席琳乔等[17]分别利用联合固氮菌株制作的接种剂接种于青稞、燕麦，对其株高、生物量及粗蛋白等都有不同程度的促进结果相一致.

固氮菌肥及CN施肥处理下的黑青稞秸秆的NDF、ADF及半纤维素含量均低于对照(CK)含量.固氮菌肥(BN-1、BN-2和BN-3)处理下拔节期到抽穗期中性洗涤纤维 (NDF)含量呈递减趋势，酸性洗涤纤维 (ADF)呈递增趋势.中性洗涤纤维 (NDF)含量显著高于酸性洗涤纤维 (ADF).这与王凯等[18]、宋萍等[19]对青稞秸秆中粗纤维含量测定的所得结论相一致.

本研究CN、BN-2、BN-3施肥处理下的黑青稞籽粒千粒重、籽粒产量均显著高于对照(CK)，但固氮菌肥BN-2和BN-3处理下的籽粒产量不及CN处理.张堃等研究的固氮菌肥接种在青稞上，在一定生育期内，半量氮肥+固氮菌肥处理表现的促生效果及产量与全量氮肥相近的结论相一致[20].

阎世江等[21]、于健等[22]研究表明不同的菌肥与化肥的施肥方式其作物其产量效果不同，外界因素如土壤类型、菌肥类型，施用方式等都可影响联合固氮菌肥的施用效果[23-24].本研究探究了单一菌株的菌肥施用效果，因此，联合固氮菌株的菌肥肥效试验还需要进一步的深入研究.

4 结论

本试验以LB培养基和腐殖土与珍珠岩为载体制作的固体菌肥经180 d，检测有效固氮菌数量均在2.00×108个/g以上，且无杂菌污染，符合《农用微生物菌剂》质量标准.

本试验制作的3种联合固氮菌肥可促进黑青稞的生长，对黑青稞主根长度、根体积、粗蛋白含量、籽粒产量，均与对照(CK)相比有促进作用；其中菌肥BN-3在制作的3种菌肥的效果最好，促进黑青稞地上部分生长，促进K、P、N的在青稞秸秆和籽粒中的积累，产量达到了3 328.2 kg/hm2，处理效果整体次于CN处理，说明研制的菌肥BN-3在一定程度上可部分替代氮肥.因此，菌肥BN-3可根据实际情况与化肥适量配合施用.