黄克强,席贻龙,朱 韩,张丙行,潘 玲

安徽师范大学生命科学学院,安徽省重要生物资源的保护和利用研究省级重点实验室,皖江城市带退化生态系统的恢复与重建安徽省协同创新中心,芜湖 241000

长期以来,学者们在污染物毒性生物监测等研究中更多地关注常规的“优先”污染物,特别是那些持久性有机物、重金属、农药、化工产品及其中间产物。然而,这些化学品仅仅是整个环境风险评价体系中的一部分,另一类数量巨大、生物活性复杂的新兴污染物很少被提及和研究,而这类新兴污染物中绝大部分是目前被大量使用的人用和兽用药物[1]。

布洛芬,又名异丁苯丙酸(或2- 4-异丁基苯基丙酸),其制剂称芬必得(布洛芬缓释剂)、大亚克芬或美林(口服液)等,属于新兴污染物,为非甾体抗炎药(NSAID),被广泛用于治疗风湿性疾病、疼痛和发烧,具有较高的治疗剂量(600—1200 mg/d)。但是,由于人们在服用后该药物以母体化合物(游离或缀合的)或以代谢物的形式排泄至显著程度(70%—80%的治疗剂量),而现有的污水处理技术又不能有效地去除它们,由此导致其在水体中长期低剂量存在,造成“假性”持久性污染[2]。布洛芬在我国地表水环境中的浓度水平较高,在辽河流域和珠江广州河段的最大检出浓度分别可达246 ng/L和1417 ng/L[3- 4],低于或接近对英国河流(432—5044 ng/L)[5]及加拿大大西洋沿岸河流(6400 ng/L)[6]的报道。水体中的布洛芬对生态环境和人类健康具有一定的风险[7]。

有关布洛芬对水生动物的慢性毒性作用已有一些报道。在个体和种群水平上,部分学者研究了布洛芬对日本青鳉(Oryziaslatipes)[8- 9]、海洋虾类(Litopenaeus)[10]、淡水腹足类(Planorbiscarinatus)[11]、枝角类(Daphniamagna和Moinamacrocopa)[9, 12- 13]、轮虫(萼花臂尾轮虫和B.havanaensis)[14]和水螅(Hydravulgaris和H.attenuata)[15- 16]形态、生长、存活、摄食、生殖、种群增长和性激素平衡等的影响；在细胞水平上,Parolini等[17]和Contardo-Jara等[18]研究了布洛芬对淡水双壳类(Dreissenapolymorpha)的细胞遗传毒性；在分子水平上,Heckmann等[12]和Wang等[13]研究了布洛芬对与大型溞解毒相关的基因表达的影响。

轮虫具有世代时间短、个体小、繁殖快速、易培养、对常见的毒物敏感性强等特点,已广泛被应用于水生态毒理学研究[19- 20]。已有的研究结果表明,污染物对轮虫的生态毒性效应常因水体中藻类等食物密度的不同而存在差异[21- 24],但布洛芬等抗炎药物对轮虫的生态毒性与食物密度之间的关系如何？不同食物密度下与环境相关浓度的布洛芬对轮虫的生态毒性是什么？所有这些问题仍有待研究。为此,本文以淡水中常见的萼花臂尾轮虫为受试生物,采用生命表试验方法,探究布洛芬浓度对轮虫生命表统计学参数的影响及其与藻密度间的关系,旨在筛选出敏感的指标用于水环境中布洛芬污染的生物监测,为探明布洛芬影响轮虫存活、生殖和种群增长的规律积累资料。

1 材料与方法

1.1 轮虫的来源和培养

受试生物萼花臂尾轮虫采于芜湖市镜湖,实验室内进行克隆培养。培养液为EPA,由96 mg NaHCO3、60 mg CaSO4、60 mg MgSO4和4 mg KCl溶解于1 L蒸馏水中配制而成[25]；食物为斜生栅藻,以HB- 4培养基[26]培养,当其处于指数增长期时离心浓缩并经显微计数后使用。实验前,将轮虫置于(25±1)℃、自然光照(光照强度约130 lx,L∶D约12∶12)的恒温培养箱内进行为期1周的预培养。期间,每天投喂密度分别为1.0×106、2.0×106个细胞/mL和4.0×106个细胞/mL的斜生栅藻并更换轮虫培养液一次,同时通过去除一部分个体使轮虫种群始终处于指数增长期。

1.2 测试液的配置

1.3 慢性毒性试验

试验设1、10、100、1000 μg/L和5000 μg/L等5个布洛芬浓度,以及1.0×106、2.0×106个细胞/mL和4.0×106个细胞/mL等3个斜生栅藻密度,各藻密度下另设置1个对照组,每组设置3个重复。实验时,将孵化出的龄长4 h内的轮虫幼体挑出,放入8 mL玻璃杯中作为受试母体,并加入5 mL测试液(其中分别含有相应密度的斜生栅藻),每个玻璃杯中放置10只轮虫幼体。实验在(25±1)℃、自然光照的恒温培养箱中进行。实验过程中,每间隔12 h观察1次并记录母体的存活数和孵化出的幼体数,移去死亡个体,并将新生的幼体移至另一玻璃杯中继续培养,待其产卵后确定雌体类型,用于计算轮虫一生所产全部后代中的混交雌体比例。每间隔24 h更换1次含有相应密度的藻类的测试液。实验进行至轮虫母体全部死亡为止。

1.4 研究参数的定义与计算方法

1.5 数据统计和分析

采用SPSS 16.0分析软件对数据进行分析。使用Kaplan-Meier分析各藻密度下布洛芬浓度对轮虫存活率的影响。对所得数据作正态性检验后,对符合正态分布的各组数据通过单因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比较(LSD检验)分析各布洛芬浓度组与空白对照组间的差异显著性,通过双因素方差分析检测布洛芬浓度、藻密度及其相互作用对轮虫各生命表统计学参数的影响；对轮虫各生命表统计学参数与布洛芬浓度之间的关系进行回归分析。

2 结果与分析

2.1 不同藻密度下布洛芬对萼花臂尾轮虫存活率和繁殖率的影响

各藻密度下,布洛芬密度对轮虫的存活率均无显著性影响(P>0.05)。当藻密度为1.0×106和2.0×106个细胞/mL时,轮虫的繁殖率峰值均在5000 μg/L的布洛芬中最高,分别为2.85个后代/雌体/12 h和3.74个后代/雌体/12 h；当藻密度为4.0×106个细胞/mL时,轮虫的繁殖率峰值在100 μg/L的布洛芬中最高,为3.90个后代/雌体/12h(图1)。

图1 不同藻密度和布洛芬浓度下萼花臂尾轮虫的存活率和繁殖率Fig.1 Survivorship and fecundity of Brachionus calyciflorus exposed to different concentrations of ibuprofen at three algal densities

2.2 不同藻密度下布洛芬对轮虫生命表统计学参数的影响

当藻密度为1.0×106个细胞/mL时,布洛芬浓度对轮虫的生命期望、平均寿命、世代时间、净生殖率和后代混交率均有显著性影响(P<0.05)。与对照组相比,100—5000 μg/L布洛芬处理组中轮虫的生命期望和平均寿命显著缩短,100 μg/L布洛芬处理组中轮虫的世代时间显著缩短,1.0 μg/L布洛芬处理组中轮虫的净生殖率显著提高,10—5000 μg/L布洛芬处理组中轮虫的后代混交率显著提高(表1)。

当藻密度为2.0×106个细胞/mL时,布洛芬浓度对轮虫的生命期望、平均寿命、世代时间、种群内禀增长率和后代混交率均有显著性影响(P<0.05)。与对照组相比,10—5000 μg/L布洛芬处理组中轮虫的生命期望和平均寿命显著缩短,1000 μg/L和5000 μg/L布洛芬处理组中轮虫的世代时间显著缩短,1、10、1000 μg/L和5000 μg/L布洛芬处理组中轮虫的种群内禀增长率显著提高,1 μg/L和1000 μg/L布洛芬处理组中轮虫的后代混交率显著提高(表1)。

当藻密度为4.0×106个细胞/mL时,布洛芬浓度对轮虫的生命期望、平均寿命和世代时间均有显著性影响(P<0.05)。与对照组相比,10—5000 μg/L布洛芬处理组中轮虫的生命期望、平均寿命和世代时间轮虫显著缩短(表1)。

表1不同藻密度和布洛芬浓度下萼花臂尾轮虫的生命表统计学参数(均数±标准误差)

Table1LifetabledemographicparametersofBrachionuscalyciflorusexposedtodifferentconcentrationsofibuprofenatthreealgaldensities

藻密度Algal density/(×106个细胞/mL)布洛芬浓度Ibuprofen concen./(μg/L)生命期望Life expectancy at hatching /h平均寿命Average lifespan /h世代时间Generation time/h净生殖率Net reproduction rate /(offspring/female/life)内禀增长率Intrinsic rate of population increase/h后代混交率Proportion of sexual offspring1.0083.2±2.171.2±2.157.4±0.78.9±1.10.0377±0.00210.058±0.0021.088.8±1.276.8±1.261.7±3.112.1±0.4∗0.0406±0.00170.084±0.00410.075.6±3.263.6±3.255.8±1.510.8±0.40.0427±0.00080.122±0.005∗100.065.6±3.8∗53.6±3.8∗47.9±2.6∗8.3±0.90.0444±0.00360.130±0.015∗1000.070.0±2.8∗58.0±2.8∗53.8±1.29.6±0.00.0420±0.00090.116±0.011∗5000.070.8±1.2∗58.8±1.2∗56.6±3.38.9±0.90.0389±0.00430.132±0.011∗2.0085.6±1.473.6±1.460.8±2.612.3±1.80.0409±0.00070.107±0.0041.086.4±3.074.4±3.058.5±1.914.4±0.70.0456±0.0012∗0.153±0.016∗10.072.8±1.1∗60.8±1.1∗55.8±1.212.0±0.30.0445±0.0012∗0.098±0.011100.072.0±2.5∗60.0±2.5∗55.5±3.011.7±1.30.0440±0.00100.113±0.0031000.068.0±0.4∗56.0±0.4∗51.9±1.2∗11.0±0.20.0462±0.0013∗0.139±0.009∗5000.064.8±2.1∗52.8±2.1∗51.2±1.0∗11.0±0.10.0469±0.0011∗0.101±0.0114.0085.2±2.573.2±2.557.8±2.215.6±2.60.0469±0.00230.115±0.0071.078.0±5.466.0±5.454.1±1.714.4±1.00.0493±0.00040.099±0.03210.075.2±2.1∗63.2±2.1∗53.1±0.3∗14.1±0.80.0498±0.00110.107±0.020100.070.8±1.4∗58.8±1.4∗50.4±0.3∗14.2±0.50.0526±0.00060.105±0.0141000.074.0±0.8∗62.0±0.8∗51.6±0.1∗16.0±0.70.0537±0.00100.089±0.0095000.060.4±0.8∗48.4±0.8∗49.4±2.3∗10.7±0.60.0481±0.00340.092±0.033

* 表示与同一食物密度下的对照组相比有显著性差异

双因素方差分析结果表明,藻密度对轮虫的世代时间、净生殖率和种群内禀增长率有显著性影响(P<0.05),布洛芬浓度对轮虫的生命期望、平均寿命、世代时间、净生殖率和种群内禀增长率有显著性影响(P<0.05),藻密度和布洛芬浓度的交互作用对轮虫的生命期望、平均寿命和后代混交率有显著性影响(P<0.05)(表2)。3个藻密度间,轮虫的世代时间在1.0×106个细胞/mL的藻密度下显著长于4.0×106个细胞/mL下,净生殖率和种群内禀增长率均随着藻密度的升高而升高。各布洛芬浓度和对照组之间,100—5000 μg/L的布洛芬显著缩短了轮虫的生命期望、平均寿命和世代时间,5000 μg/L的布洛芬显著降低了轮虫的净生殖率,1—1000 μg/L的布洛芬显著降低了轮虫的种群内禀增长率。

表2藻密度和布洛芬浓度对萼花臂尾轮虫生命表统计参数的影响(双因素方差分析)

Table2EffectsofalgaldensityandibuprofenconcentrationonlifetabledemographicparametersofBrachionuscalyciflorus(Two-way ANOVA)

参数Parameter差异源Source平方和Sum of squares自由度Degree of freedom均方Mean squareFP生命期望食物密度(A)27.25213.630.77P>0.05Life expectancy 布洛芬浓度(B)2922.455584.4933.06P<0.01at hatchingA×B478.351047.842.71P<0.05误差636.483617.68平均寿命食物密度(A)27.25213.630.77P>0.05Average布洛芬浓度(B)2922.455584.4933.06P<0.01lifespanA×B478.351047.842.71P<0.05误差636.483617.68世代时间食物密度(A)97.40248.704.33P<0.05Generation time布洛芬浓度(B)445.24589.057.91P<0.01A×B209.131020.911.86P>0.05误差405.113611.25净生殖率食物密度(A)172.21286.1028.30P<0.01Net布洛芬浓度(B)59.02511.813.88P<0.01reproductionA×B49.19104.921.62P>0.05rate误差109.52363.04内禀增长率食物密度(A)0.0020.0033.17P<0.01Intrinsic rate of布洛芬浓度(B)0.0053.51×10-53.16P<0.05populationA×B8.65×10-5108.65×10-60.78P>0.05increase误差0.00361.11×10-5后代混交率食物密度(A)0.00320.0012.074P>0.05 Proportion of布洛芬浓度(B)0.00350.0010.927P>0.05sexualA×B0.019100.0022.907P<0.01offspring误差0.024360.001

2.3 不同藻密度下轮虫生命表统计学参数与布洛芬浓度间的关系

回归分析结果显示,在实验设置的布洛芬浓度范围内,在2.0×106个细胞/mL藻密度下,轮虫的生命期望、平均寿命和世代时间与布洛芬浓度之间均具有显著的剂量-效应关系(P<0.05)。4.0×106个细胞/mL藻密度下,轮虫的生命期望、平均寿命和净生殖率与布洛芬浓度之间均具有显著的剂量—效应关系(P<0.05)(表3)。

表3各藻密度下萼花臂尾轮虫的生命期望、平均寿命、世代时间和净生殖率与布洛芬浓度间的关系

Table3Therelationshipsbetweenlifeexpectancyathatching,averagelifespan,generationtimeaswellasnetreproductionrateofBrachionuscalyciflorusculturedatthreealgaldensitiesandibuprofenconcentration

藻密度(个细胞/mL)Algal density参数Parameters回归方程Regressive equation显著性差异Significant test2.0×106 生命期望y=2.419×10-6x2-0.015x+79.818R2=0.536, P<0.01平均寿命y=2.419×10-6x2-0.015x+67.818R2=0.536, P<0.01世代时间y=1.229×10-6x2-0.007x+57.941R2=0.462, P<0.054.0×106生命期望y=2.483×10-7x2-0.005x+77.624R2=0.551, P<0.01平均寿命y=2.483×10-7x2-0.005x+65.624R2=0.551, P<0.01净生殖率y= -5.434×10-7x2+0.002x+14.530R2=0.439, P<0.05

3 讨论

3.1 布洛芬浓度和藻密度对浮游动物存活和生殖的影响

已有研究结果表明,较高浓度的布洛芬对枝角类和轮虫的存活产生不利的影响。如80.0 mg/L的布洛芬使大型溞(D.magna)的存活率显著降低,100.0 mg/L的布洛芬使大型溞无法存活[9,12]；12.5 mg/L的布洛芬使萼花臂尾轮虫的平均寿命显著缩短,25.0 mg/L的布洛芬使哈瓦那臂尾轮虫(B.havanaensis)的平均寿命显著缩短[14]。本研究结果也表明,较高浓度的布洛芬使萼花臂尾轮虫的生命期望和平均寿命显著缩短,藻密度由1.0×106个细胞/mL升高至2.0×106个细胞/mL和4.0×106个细胞/mL使布洛芬对轮虫存活的最低可观察效应浓度(LOEC)降低(由100 μg/L降低至10 μg/L)。

较高浓度的布洛芬对枝角类和轮虫的生殖也具有不利的影响。如50.0 mg/L的布洛芬使多刺裸腹溞(M.macrocopa)的净生殖率显著降低[12],25.0 mg/L的布洛芬使萼花臂尾轮虫的净生殖率显著降低,6.25—25.0 mg/L的布洛芬使哈瓦那臂尾轮虫的净生殖率显著降低[14]。与上述结果不同的是,本研究所测试的大多数浓度的布洛芬对轮虫的净生殖率均无显著的影响,这可能与所测试的布洛芬最高浓度(5000 μg/L)较低有关。此外,当斜生栅藻密度为1.0×106个细胞/mL时,1.0 μg/L的布洛芬使轮虫的净生殖率显著高于对照组。究其原因,可能与布洛芬具有雌激素活性[12]有关。一些已被证明具有环境雌激素效应的、较低浓度的污染物也可以促进轮虫的生殖,如20—320 μg/L的艾氏剂、0.5—50.0 μg/L的十氯丹和100—900 μg/L的Zn2+显著提高了萼花臂尾轮虫的净生殖率[24, 27- 28]。

3.2 藻密度和布洛芬浓度对浮游动物种群增长影响

有研究发现,50.0 μg/L的布洛芬使大型溞的种群增长率显著降低[12- 13],12.5—25.0 mg/L的布洛芬使哈瓦那臂尾轮虫的种群增长率显著降低[14],但0.0125 mg/mL的氯霉素、0.2500 mg/mL和0.5000 mg/mL的盐酸氟哌酸均显著地促进褶皱臂尾轮虫(B.plicatilis)的种群增长[29],6.25 μg/mL的红霉素和氯霉素均显著地促进萼花臂尾轮虫的种群增长[30]。当藻密度为2.0×106个细胞/mL时,除了0.3 mg/L外,其他浓度的 Zn2+显著提高了萼花臂尾轮虫的种群内禀增长率；当藻密度为 4.0×106个细胞/mL时,0.1、0.3 mg/L和0.7 mg/L的Zn2+显著提高了萼花臂尾轮虫的种群内禀增长率[24]。当藻密度为2.0×106个细胞/mL和4.0×106个细胞/mL时,各浓度的利福平均显著提高了萼花臂尾轮虫的种群內禀增长率[23]。本研究所测试的布洛芬浓度均对萼花臂尾轮虫的种群增长具有促进作用,促进作用的显著性与否取决于藻类食物密度。当藻密度为1.0×106个细胞/mL和4.0×106个细胞/mL时,布洛芬浓度对轮虫的种群增长率均无显著性影响；但当藻密度为2.0×106个细胞/mL时,1、10、1000 μg/L和5000 μg/L的布洛芬显著提高了轮虫的种群内禀增长率。一定浓度的布洛芬等水体污染物对轮虫种群增长的促进作用,可能与其所具有的雌激素效应有关。

3.3 藻密度和布洛芬浓度对轮虫有性生殖的影响

混交雌体的产生是轮虫有性生殖的开始,对轮虫产生休眠卵以适应不利的环境条件具有重要的意义。已有的研究表明,一定浓度的、具有雌激素活性的水体污染物,如500 μg/L的邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、50 μg/L和500 μg/L的邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)以及500 μg/L的邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)使萼花臂尾轮虫的后代混交率显著升高[31]；各藻密度下,各浓度的利福平都使萼花臂尾轮虫的后代混交率显著升高[23]。本研究结果表明,布洛芬对轮虫后代混交率的显著促进作用取决于藻类食物密度。当藻密度为1.0×106个细胞/mL时,10—5000 μg/L的布洛芬显著提高了轮虫的后代混交率；随着藻密度的升高,布洛芬对轮虫后代混交率的显著促进作用逐渐消失。

3.4 轮虫各生命表统计学参数对污染物的敏感性

轮虫各生命表统计学参数对污染物的敏感性常因污染物种类的不同而异。储昭霞[32]、Rao和Sarma[21]、Xi和Hu[33]均发现,轮虫种群内禀增长率是低浓度水体污染物毒性检测的一个很敏感指标；Ferrando等[34]发现净生殖率和种群增长率是比世代时间和生命期望更敏感的指标；Janssen等[35]、徐晓平等[36]和Araujo等[37]发现种群内禀增长率并不总是最敏感的指标,净生殖率有时具有更低的LOEC值；翟盼等[23]发现各藻密度下,轮虫后代混交率是最敏感的指标。本研究结果表明,轮虫生命表统计学参数对布洛芬污染的敏感性与藻密度有关。在较低的藻密度(1.0×106个细胞/mL)下,轮虫的净生殖率最敏感；在中等藻密度(2.0×106个细胞/mL)下,轮虫的种群内禀增长率和后代混交率较敏感；而在较高的藻密度(4.0×106个细胞/mL)下,轮虫的生命期望、平均寿命和世代时间较敏感。