刘子记 牛 玉 杨 衍

(中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 海南儋州571737)

苦瓜（Momordica charantiaL.， 2n = 2x =22）属于葫芦科（Cucurbitaceae）一年生蔓生草本植物，起源于非洲，共包括59 个种，其中47 个种分布于非洲，12 个种分布于亚洲和大洋洲，在热带、亚热带和温带地区有着悠久的栽培历史［1-2］。苦瓜富含维生素C、维生素E 及多种矿物质，具有很高的营养价值。另外，苦瓜所含的药理活性成分具有显著的抗肿瘤［3-4］、降血糖［5］、消炎［6］和提高人体免疫力［7］等多种功效。随着消费者对苦瓜营养价值和药用价值的充分认识，苦瓜生产迅速发展，推动了苦瓜研究工作的深入开展。构建遗传连锁图谱是分析遗传变异、基因定位和进行分子标记辅助育种的基础。近年来，随着分子标记技术的发展，苦瓜遗传连锁图谱的构建研究取得了较大的进展，大大促进了重要农艺性状基因的定位及比较基因组学研究。本文总结了苦瓜遗传连锁图谱构建及数量性状定位的研究进展，以期为苦瓜重要农艺性状基因克隆及分子标记辅助选择育种提供参考。

1 基于一代、二代分子标记构建苦瓜遗传图谱的研究现状与比较分析

张长远［8］以野生苦瓜材料M041530 和栽培种苦瓜材料CY013 杂交产生的F2代作图群体为材料，利用SRAP 标记构建了苦瓜遗传连锁图谱，图谱包括127 个标记，共18 个连锁群，图谱全长2094.2 cM，标记间的平均距离为16.5 cM（表1）。图谱上存在明显的3 个偏分离区域，分别位于第LG-8、LG-9和LG-18连锁群上。采用复合区间作图法对单株产量、单株结果数量、果实纵径、果实横径、肉厚、单果重量等性状进行了QTL分析，分别找到控制单株产量、单株结果数量、果实纵径、果实横径、单果重量等QTL 各1 个，遗传贡献率分别为11.66%、16.05%、13.59%、11.66%和14.03%。尽管SRAP 标记可以用于构建遗传图谱，但通用性较差，该遗传图谱标记数目较少，标记间的遗传距离较大，很难筛选到与目标性状紧密连锁的标记，另外，研究中定位的QTL位点能够解释的遗传变异较小，多属于微效基因位点。

Wang 等［9］以苦瓜雌性系Z-1-4 和自交系189-4-1 杂交产生的F2群体为试验材料，基于SSR、AFLP 和SRAP 标记构建了苦瓜遗传连锁图谱，图谱共194 个标记位点，包括26 个EST-SSR 标记位点，28 个SSR 标 记 位点，124 个AFLP 标记位点 和16 个SRAP 标记位点。图谱全长1 009.5 cM，共包括12个连锁群，标记之间的平均距离5.2 cM（表1）。在构建遗传图谱的基础上对22 个农艺性状进行了QTL 定位，在3 个环境中共检测出9 个稳定的主效QTL 位点，其中2 个QTL 位点控制雄花高度，2 个QTL 位点控制雄花节位，1 个QTL 位点控制雌花节位，2个QTL位点控制雌花节率，2个QTL位点控制单株产量。QTL 分布热点区域位于LG-1、LG-4 和LG-5 连锁群，这些热点区域可能具有一因多效。本研究与张长远［8］的研究结果相比，标记数量有所增加，并且采用了SSR标记，可用于图谱间的比较研究，另外，本研究采用了AFLP 标记，进一步增加了图谱密度，标记间的距离有所变小，但AFLP 标记和SRAP 标记通用性较差，难以进行图谱整合研究。

米军红［10］以高抗白粉病野生苦瓜材料MC18 和高感白粉病苦瓜材料MC1-2 杂交产生的F2群体为研究材料，利用SRAP 和SCAR 标记构建了苦瓜遗传图谱并对抗白粉病基因进行了QTL定位，图谱共包括11 个连锁群，LG-1 长1 676.7 cM，共包括18 个标记，LG-2 长1 213.9 cM，共包括10 个标记，LG-3长154.6 cM，包括2 个标记，其余连锁群各由1 个标记构成（表1），抗白粉病基因被定位在LG-2 连锁群，鉴定出5 个与抗白粉病基因连锁的SRAP 分子标记，并将其中1个SRAP标记转化成SCAR标记。与张长远［8］和Wang等［9］构建的遗传图谱相比，该遗传图谱的标记数量较少，尽管连锁群的数量与苦瓜染色体数目一致，但多个连锁群仅包括1个标记，很难说明连锁群与染色体的对应关系。本研究基于该遗传图谱首次定位了抗白粉病基因位点，为苦瓜的抗病育种奠定了基础。

Kole 等［11］以苦瓜品系台湾白和CBM12 杂交产生的F2群体为研究对象，F2群体共包括146 个单株，利用AFLP 标记构建了苦瓜遗传连锁图谱，图谱共包括11 个连锁群，108 个AFLP 标记，图谱全长3 060.7 cM，标记间的平均距离为22.75 cM，其中7 个连锁群分别包括9～28 个标记，长234.7～889.8 cM，其余4 个连锁群分别包括2～5 个标记，长16.6～78.5 cM。标记存在严重的偏分离现象（表1）。基于该图谱定位了5 个质量性状，分别为果实颜色、果实光泽、果实表皮结构、柱头颜色和种子颜色。12 个控制果实形状的QTLs 分别被定位在5 个连锁群，能够解释11.1%～39.7%的表型变异。与张长远［8］、Wang等［9］和米军红［10］构建的图谱相比，该图谱主要基于AFLP 标记，不仅标记间遗传距离较大，并且标记在连锁群上的分布存在明显的偏分离情况。

综上，基于一代、二代分子标记构建的苦瓜遗传连锁图谱主要采用SRAP 和AFLP 分子标记，属于显性标记，尽管这些标记可以加速遗传图谱构建的进程，但通用性较差，不能有效进行遗传图谱的整合。另外基于显性标记构建遗传图谱会过分估计连锁群的长度，图谱饱和度较低，定位的重要农艺性状QTL较少，限制了其在分子辅助选择方面的应用。与SRAP 和AFLP 标记相比，SSR 标记共显性遗传、易于操作，适合进行连锁图谱的构建及图谱间的比较分析，Wang 等［9］开发利用了部分SSR 分子标记，但SSR 标记数量非常有限。为了进一步构建苦瓜高密度遗传连锁图谱及加强图谱间的比较分析需要进一步开发通用性较好，多态性较高，在染色体上分布较为均匀的分子标记。

2 基于第三代高通量分子标记构建苦瓜遗传图谱的研究现状与比较分析

基于一代、二代分子标记构建的苦瓜遗传图谱饱和度较低，很难鉴定到与目标性状紧密连锁的分子标记，限制了其在苦瓜遗传改良中的应用。为了构建苦瓜饱和的遗传连锁图谱，确定与目标基因紧密连锁的分子标记，需要进一步开发高通量的分子标记。近年来，基于下一代测序（next generation sequencing，NGS）的基因分型方法，包括限制性相关DNA 标记测序（restriction-associated DNA tag sequencing，RAD-seq）和基于测序进行基因分型（genotyping-by-Sequencing，GBS）被作为遗传作图的有效工具。这两种方法对基因组中特定位置的短片段进行测序并计算其频率，个体之间的DNA多态性表现为这些短序列的有无。这些基于测序的基因分型工具可同时鉴定数千个全基因组范围的多态性。

Matsumura 等［12］为了鉴定与纯雌性基因连锁的分子标记，利用RAD-seq分析技术检测基因组范围的DNA 多态性，利用纯雌性系OHB61-5 和雌雄同株系OHB95-1A 杂交产生的F2群体对多态性位点进行基因型分析，基于552 个共显性的RAD-tag 标记构建了苦瓜连锁图谱，共包括15 个连锁群，图谱全长1 821 cM（表1）。纯雌性位点Mcgy 被定位在第一连锁群的末端，与Mcgy最近的标记为GT1998，该标记由一个等位性标签组成，该SNP 在OHB61-5中为C 类型，在OHB95-1A 中为T 类型，GT1998 与Mcgy 位点的遗传距离为8.33 cM。为了进一步开发与纯雌性紧密连锁的标记，构建了纯雌性系混池和雌雄同株系混池，结合亲本池，基于RAD-seq技术确定了与纯雌性位点紧密连锁的SNP 标记GTFL-1，该标记与Mcgy 位点的遗传距离为5.46 cM。本图谱包括的标记数量显著高于张长远［8］、Wang等［9］、米军红［10］和Kole 等［11］构建的图谱，图谱的密度显著提高。但是在该研究中，连锁群的数目（15 个连锁群）并没有覆盖已知的染色体数目（11 条染色体），一些连锁群只包含有限的标记数量。这些结果很可能是由于标记位置在分析群体中存在偏差，或者相同染色体上的连锁群存在分离。为了解决这些问题，有必要增加标记密度或更换作图群体。在RAD-seq分析时采用不同限制性内切酶可能会增加标记的数量。另外，增加F2个体的数量将有助于绘制精确的连锁图谱。然而，当一个作图群体的双亲序列差异较小时，通过更换限制酶或增加群体规模来精确定位纯雌性基因也是很困难的。

Urasaki 等［13］以OHB61-5 和OHB95-1A 杂交 产生的F2群体为研究对象基于RAD-seq 分析方法构建了苦瓜遗传图谱。图谱共包括1423 个标记位点，11个连锁群，图谱全长3 426 cM（表1）。根据标记在参考基因组序列中的位置，可以将255个序列骨架锚定到所构建的连锁图上，每个骨架序列中的RAD 标记位置几乎与遗传图谱中的顺序一致。Urasaki 等［13］和Matsumura 等［12］基于相同的作图群体构建了苦瓜遗传连锁图谱，但Urasaki 等［13］构建的图谱饱和度更高，图谱包含的标记数量高于Matsumura 等［12］的2 倍，图谱长度几乎是Matsumura 等［12］的2 倍，连锁群的数目与苦瓜染色体数量一致。

遗传作图是锚定组装序列和鉴定控制重要性状QTLs 的基本工具。Cui 等［14］构建了一个基于RAD-seq 的苦瓜遗传图谱，作图群体来源于纯雌性系“k44”和雌雄同株系“dali-11”杂交产生的F2群体，共包括423个个体。该遗传图谱共包括11个连锁群，1009个SNP标记，图谱全长2 203.95 cM，标记间的平均距离为2.18 cM（表1）。该图谱共锚定了113个组装序列，全长251.32 Mb，占组装基因组序列的85.48%。连锁群重组率的变幅为6.91～11.04 cM/Mb。此外，采用定性和定量相结合的方法，对三个重要性状进行了定位，包括性别表达、果实表皮结构和未成熟果实颜色。在三个环境中鉴定了3 个与这些性状相关的QTL 位点，其中QTL位点gy/fffn/ffn 控制纯雌性、第一雌花节位和雌花数量。两个QTL 位点，Fwa/Wr 和w，分别控制果实表皮结构和白色未成熟果实颜色。该遗传图谱的构建促进了苦瓜基因组的组装，将进一步加速相关基因的克隆。该遗传图谱包含的标记数量显著 高 于 张 长 远［8］、Wang 等［9］、米 军 红［10］、Kole等［11］和Matsumura 等［12］构建的图谱，与Urasaki等［13］构建的图谱标记数量相当。该遗传图谱的平均标记密度为0.46 maker/cM，高于Matsumura等［12］（0.30 maker/cM） 和Urasaki 等［13］（0.42 maker/cM）的研究结果。该研究之所以标记密度较高，可能与选择的限制性酶有关。该研究采用EcoRI 消化基因组DNA 进行RAD-seq 分析，但Matsumura 等［12］和urasaki 等［13］分别使用了PacI 和AseI。在未来，筛选使用其它限制酶或许有助于构建饱和的苦瓜遗传图谱。

Gangadhara Rao 等［15］建立了苦瓜高密度、高分辨率遗传图谱。共开发了2013 个高质量SNP 标记，图谱共包括20个连锁群，全长2 329.2 cM，每个连锁群的长度从LG-12 185.2 cM到LG-17 46.2 cM不等，连锁群的平均长度为116.46 cM。每个连锁群中的SNP 标记的数量从LG-20 中的23 个标记到LG-1 中的146 个标记不等，平均每个连锁群含有100.65 个SNP 标记。20 个连锁群标记之间的平均距离为1.16 cM（表1）。每个连锁群标记之间的平均距离从LG-4 0.70 cM 到LG-20 2.92 cM 不等。共鉴定出与4个性状（雌性、性别比、节位和雌花始花期）相关的22个QTLs位点，分布在20个连锁群上。gy-1 基因位点被定位在第12 连锁群上，两侧的标记为TP_54865 和TP_54890，与TP_54890 的距离为3.04 cM。该遗传图谱包括的标记数量显著高于张长远［8］、Wang 等［9］、米军红［10］、Kole 等［11］、Matsumura 等［12］、Urasaki 等［13］和Cui 等［14］构建的苦瓜遗传图谱。标记密度（0.86 marker/cM）显著高于Matsumura 等［12］（0.30 marker/cM）、Urasaki 等［13］（0.42 marker/cM）和Cui 等［14］（0.46 marker/cM）的研究结果。本研究构建的遗传图谱共包 括20 个连 锁群，明 显 多于Matsumura 等［12］、Urasaki 等［13］和Cui 等［14］的研究结果，远远超过了苦瓜单倍体染色体数目，这可能是由于F2群体过小或与作图群体的类型有关。为了解决这些问题，可以试图通过增加作图群体规模或采用RIL群体替换F2作图群体进行改善。本研究进一步说明，在构建苦瓜遗传图谱研究中，GBS 技术略优于RAD-seq技术。

表1 苦瓜遗传连锁图谱

3 结论

构建高密度的遗传连锁图谱是分析遗传变异、基因定位、基因克隆和进行分子标记辅助育种的基础。图谱的饱和程度及标记的类型是影响图谱应用效果的关键［16］。尽管苦瓜遗传图谱的研究工作取得了一定进展，但仍存在一些不足。基于一代、二代分子标记构建的苦瓜遗传图谱，标记间的距离较大，饱和度较低，很难鉴定与目标基因紧密连锁的分子标记。另外，基于一代、二代和三代分子标记构建的苦瓜遗传图谱均基于F2群体，利用F2群体构建遗传连锁图谱进行相关QTL 分析具有一定的局限性，很难进行多年多点分析，由于RILs 永久作图群体可以在不同时间和地点对性状进行测量，可以大大降低试验误差，提高分析结果的准确度［17］。因此为了提高图谱的精确度和准确度，在未来苦瓜遗传图谱的构建过程中，可以构建RILs 作图群体，另外一方面可以比较整合现有遗传图谱，最终构建高密度的苦瓜遗传连锁图谱。

本文总结了苦瓜遗传连锁图谱构建的研究现状，为进一步剖析苦瓜重要性状基因关键位点奠定了基础。有助于开发与重要农艺性状紧密连锁的分子标记，开展分子辅助选择育种，推动苦瓜分子育种的进程。