王　涛　陈奕君　史　楚　刘吉升

家蚕肽聚糖识别蛋白的研究进展

王涛陈奕君史楚刘吉升

（广州大学生命科学学院广东广州510006）

先天免疫是昆虫唯一的防护屏障，肽聚糖识别蛋白作为先天免疫中重要的免疫因子，在识别病原物，激活Toll通路和IMD通路，调节昆虫体内免疫应答等反应中起关键性作用。肽聚糖识别蛋白在复杂的免疫反应中担任多种角色，文章从发现、分类、功能等多方面介绍了昆虫的肽聚糖识别蛋白，并且对家蚕体内的12 种肽聚糖识别蛋白的研究进展进行了汇总，进一步了解家蚕先天免疫系统的分子机制和调控机制。

家蚕；先天免疫；病原相关分子模式；肽聚糖识别蛋白

免疫系统是生物进化过程中形成的自我防御机制，包括先天性免疫（innate immune）和获得性免疫（adaptive immunity）。昆虫没有像其他高等动物一样进化出获得性免疫系统，因此主要依靠自身的先天性免疫系统抵御病毒、细菌、真菌等外源物的侵害[1]。昆虫的先天性免疫主要包括细胞免疫（cellular immunity）和体液免疫（humoral immunity）。细胞免疫是由免疫细胞介导的吞噬，集结和包囊作用[2]，和高等动物基本一致。而体液免疫则与高等动物不同，他们不产生抗原-抗体反应，而是以抗菌肽、溶菌酶、凝集素、蛋白抑制剂以及抗病毒因子等多种活性因子联合血细胞建立一个开放完整的免疫防御体系[3]。当外源物进入体腔后，昆虫通过体内的模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs）识别外源物表面的病原相关分子模式（pathogen associated molecular patterns, PAMPs），迅速产生一系列分子信号，激活Toll通路、IMD通路、JAK-STAT通路等先天免疫反应中的重要通路，对抗病菌[4]。

1 病原相关分子模式

模式识别受体是先天性免疫反应中一类保守的蛋白受体，是触发免疫反应的关键，主要包括脂多糖结合蛋白（lipopolysaccharide binding proteins, LBPs）、肽聚糖识别蛋白（peptidoglycan recognition proteins, PGRPs）、β-1, 3-葡聚糖结合蛋白（β-1, 3-glucan binding proteins, βGRPs）等[5]。病原相关分子模式则是指病原物表面一种保守的分子模式，是一种无特定结构的生物大分子，主要包括肽聚糖（peptidoglycan, PGN）、脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）、葡聚糖（glucan）、脂磷壁酸（lipoteichoic acid）和甘露聚糖（glucomannan）等[6]。不同的病原相关分子模式能被不同的模式识别蛋白识别并结合，肽聚糖便是肽聚糖识别蛋白的靶标[7]。有趣的是，根据构成肽聚糖多肽链上的第三个氨基酸的不同，以及四肽尾之间连接方式的不同，肽聚糖又可分为L-赖氨酸型（Lys-PGN），主要存在于革兰氏阳性菌，和二氨基庚二酸型（Dap-PGN），主要存在于革兰氏阴性菌[8]。革兰氏阳性菌细胞壁最外层是肽聚糖（Lys-PGN），能被果蝇Drosophila melanogaster的肽聚糖识别蛋白识别，当Lys-PGN入侵机体时，被胞外的肽聚糖识别蛋白识别并结合，在DmPGRP-SA, DmPGRP-SD和GNBP三种蛋白协同作用下，Spatzle前体蛋白被切割，形成可以与Toll受体蛋白结合的Spatzle蛋白二聚体，从而激活Toll免疫通路，传递免疫信号至细胞核，产生抗菌肽基因。而果蝇IMD通路则是被革兰氏阴性菌细胞壁中的Dap-PGN激活。两种细菌对果蝇的免疫激活是不同的，分别启动不同的免疫通路[9]。

2 肽聚糖识别蛋白

先天免疫是昆虫唯一的防护屏障，肽聚糖识别蛋白作为先天免疫中重要的免疫因子，在识别病原物、激活Toll通路和IMD通路、调节昆虫体内免疫应答等反应中起关键性作用。当外界的细菌，真菌等微生物入侵机体时，被机体内的肽聚糖识别蛋白识别：（1）激活细胞免疫反应，由血细胞调控，将入侵的外源病原物杀死；（2）将此识别信号逐级传递放大，激活体液免疫通路，产生效应物，从而抵御入侵的外源病原物[10]。肽聚糖识别蛋白家族的成员在这一复杂的响应过程中担任多种角色，主要包括：（1）能结合病原物表面的肽聚糖的识别受体功能；（2）能调控抗菌肽合成，细胞吞噬等作用的调节子功能；（3）具有裂解肽聚糖的酰胺酶活性和凝集作用的效应因子功能[8]。

1996年Yoshida等人在家蚕Bombyxmori的血淋巴中发现并提取了一个能特异性结合革兰氏阳性菌细胞壁上的肽聚糖的蛋白，后被鉴定为BmPGRP-S1，对肽聚糖有较高的结合活性，且能激活酚氧化酶原系统（prophenoloxidase activating system）级联反应，表明此蛋白参与了免疫反应，这是昆虫体内发现的第一个肽聚糖识别蛋白[11]。此后，又陆续在其他昆虫和哺乳动物体内发现了约100 种肽聚糖识别蛋白。PGRPs是一段高度保守的氨基酸序列，都具有一个约165 个氨基酸大小的PGRP结构域，该结构域与N-乙酰胞壁酸-丙氨酸酰胺酶和T7溶菌酶同源[12]。T7溶菌酶是一个Zn2+依赖性的水解酶，PGRPs具有Zn2+依赖性的5 个关键残基（H-Y-H-T-C）时，也能像T7溶菌酶一样打断糖链上N-乙酰胞壁酸与L-丙氨酸之间的酰胺键裂解肽聚糖[12]。当肽聚糖识别蛋白缺失一个或几个残基时，就不能裂解肽聚糖，不具有酰胺酶活性[12]。根据肽聚糖识别蛋白分子量的大小，又可将其分为长型（L）和短型（Ｓ）。果蝇所编码的17 个肽聚糖识别蛋白中，7 个为短型，含信号肽但不含有跨膜区，可能以分泌的形式存在。10 个为长型，长型当中一部分含信号肽和跨膜区，可能以跨膜的形式存在，一部分不含信号肽和跨膜区，可能在胞内行使功能。一般情况下长型具有多种剪切形式，比短型复杂的多[13～14]。另外，冈比亚按蚊Anopheles gambiae中也发现了7种PGRPs，至少编码9 种蛋白，4 种短型，5 种长型。西方蜜蜂Apis mellifera中发现了1种长型，1种短型。巴西白斑弄蝶Calpodes中发现了1 种短型。舌蝇Glossina morsitans中发现2 种长型。大蜡螟Galleria mellonella中发现2 种。烟草天蛾Manduca sexta中发现2 种长型。黄粉虫Tenebrio molitor中发现1 种长型。人Homo sapiens和小鼠Mus musculus体内发现4种PGRPs。家蚕作为鳞翅目的模式生物，近几年也展开了对肽聚糖识别蛋白的研究。2008年Tanaka等人在家蚕体内鉴定出12 种肽聚糖识别蛋白，6 种长型，6 种短型[15]。

3 家蚕肽聚糖识别蛋白的功能研究

家蚕是我国重要的经济昆虫，也是第一个完成全基因组测序的鳞翅目昆虫，是鳞翅目模式生物。到目前为止，已经对家蚕12 种肽聚糖识别识别蛋白进行了初步分析。6 个短型的肽聚糖识别蛋白不含跨膜区，但都含有信号肽，为分泌型蛋白。6 个长型的肽聚糖识别蛋白较为复杂，可能存在多种剪切形式。2010年许平震等对家蚕体内的部分（10 种）肽聚糖识别蛋白的基因做了分析和表达谱[16]。5 种短型分别是BmPGRP-S1, BmPGRP-S2, BmPGRP-S3, BmPGRP-S4, BmPGRP-S5。5 种长型分别是BmPGRP-L1, BmPGRP-L2, BmPGRP-L3, BmPGRP-L4, BmPGRP-L5。5 个长型PGRPs分布于1 号染色体，5 个短型PGRPs当中，BmPGRP-S1, BmPGRP-S2分布于9号染色体，BmPGRP-S3, BmPGRP-S5分布于16 号染色体。基因芯片数据显示BmPGRP-L5基因在5龄第3天的幼虫的各个组织中无表达，其余9 个PGRPs均为多组织表达。

12 个肽聚糖识别蛋白中BmPGRP-S1, BmPGRP-S2, BmPGRP-S3, BmPGRP-S4, BmPGRP-S5, BmPGRP-L1, BmPGRP-L6已有较深入的研究报道。1996年Yoshida等人对BmPGRP-S1的研究表明，BmPGRP-S1对革兰氏阳性菌的肽聚糖有很强的亲和力，在没有Ca2+存在的情况下，能与PGN结合，而不能与几丁质和β-1, 3-葡聚糖结合。在BmPGRP-S1缺失的情况下，肽聚糖无法激活酚氧化酶原系统级联反应，BmPGRP-S1可能参与家蚕体内酚氧化酶原系统级联反应的激活[11]。这些功能特征在家蚕其他的肽聚糖识别蛋白中普遍存在。BmPGRP-S4和BmPGRP-S5也能激活酚氧化酶原系统级联反应[17～19]。关于酰胺酶活性的研究表明，BmPGRP-S4和BmPGRP-S5都具有酰胺酶活性和抗菌活性，能引起细菌发生凝集反应[17～19]。BmPGRP-L6和BmPGRP-L1作为长型的肽聚糖识别蛋白，都因缺乏酰胺酶活性的几个关键性残基而不具有酰胺酶活性[20～21]。关于肽聚糖结合试验的结果表明，BmPGRP-S4主要结合Dap-PGN[19]，BmPGRP-S5对Lys-PGN有较强的结合力，对Dap-PGN的结合能力较弱[18]，BmPGRP-L1和BmPGRP-L6都可以结合两种类型的肽聚糖[20～21]。通过外源物感染发现，BmPGRP-S2基因能被革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌诱导上调表达[22]。感染家蚕质多角体病毒（Cytoplasmic Polyhedrosis Virus, CPV）后，BmPGRP-S3基因相对表达水平显著上调[22]。感染革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌后，BmPGRP-S4基因在中肠中强烈诱导，BmPGRP-S5基因在脂肪体和中肠中显著上调[17～19]。根据RNA干扰技术发现，RNA敲除BmPGRP-S2基因后，导致转录因子Relish, Attacin, Gloverin和Moricin等IMD通路下游的抗菌肽基因的下调表达，这表明BmPGRP-S2基因可能参与IMD信号通路[23]。BmPGRP-L6基因和BmPGRP-S5基因也做了RNA敲除实验，敲除BmPGRP-L6基因和BmPGRP-S5基因之后，再进行微生物感染，被大肠杆菌感染后的抗菌肽基因出现了下调，这说明，这两个基因也与IMD途径的激活有关系[20]。体内阻断BmPGRP-L1蛋白后，抗菌肽基因表达水平下降。S2细胞中BmPGRP-L1基因与BmIMD基因的过表达结果显示，抗菌肽基因被诱导上调表达。免疫共沉淀反应未能检测到BmPGRP-L1基因与BmIMD基因之间存在相互作用关系[21]，而BmPGRP-S2, BmPGRP-S5, BmPGRP-L1, BmPGRP-L6均被指出与IMD途径存在联系，具体与IMD途径存在何种联系，肽聚糖识别蛋白之间是否存在互相作用的关系，还需进一步探讨。

4 小结

蚕丝业起源于中国，距今已有五千多年的历史，从古代的“丝绸之路”到如今的“一带一路”，都与蚕丝产业息息相关[24]。我国的蚕丝生产量占世界蚕丝生产总量的75 ％以上。而蚕病深受天气条件的制约，发病率高，处理不及时和措施不得力的农户基本颗粒无收，损失惨重[25]。目前，传染性蚕病尚无特效药治疗，以预防和灭菌为主。

近年来，通过模拟自然环境的微生物感染和一系列分子生物学技术手段分析了部分肽聚糖识别蛋白在家蚕免疫反应中的作用，进行了基因与蛋白的功能性研究，使我们对家蚕的免疫反应有了进一步的认识，但仍不够深入。机体的免疫反应是相辅相成，息息相关的。在果蝇中，激活Toll通路需要至少PGRP-SD, PGRP-SA和GNBP等三种蛋白协同作用，是一个复杂的免疫响应过程[26]。果蝇PGRP-SC2能抑制IMD途径的活化，却能激活Toll通路[27]。在小菜蛾中的研究中表明，PxPGRP-LC可以单独发挥作用，也可能作为其他PGRP受体的辅助受体发挥作用[28]。因此，还需对家蚕肽聚糖识别蛋白进行更深入更系统的研究，有助于明确家蚕免疫系统的分子机制和调控机制，对蚕病的防治有一定的意义，同时为鳞翅目其他物种在免疫方面的研究提供经验。

[1]Lavine MD,Strand MR.Insect hemocytes and their role in immunity.Insect Biochem.Mol.Biol,2002,32(10):1295-1309.

[2]吴姗,凌尔军.昆虫细胞免疫反应中的吞噬､集结和包囊作用.昆虫学报,2009,52(7):81-88.

[3]黄自然,陈劲伟.昆虫防御机制研究的一些进展.生物学通报,1990(10):9-10.

[4]Yu XQ.Pattern recognition proteins in Manducasexta plas ma.Insect Biochem Mol Biol,2002,32(10):1287-1293.

[5]Lemaitre B,Reichhart JM,Hoffmann JA.host defense:differential induction of antimicrobial peptide genes after infection by various classes of microorganisms.Proc Natl Acad Sci U S A,1997,94(26):14614-14619.

[6]Fabrick JA,Baker JE,Kanost MR.cDNA cloning,purification,properties,and function of a β-1,3-glucan recognition protein from a pyralid moth,.Insect Biochem.Mol.Biol,2003,33(6):579-594.

[7]Wolf AJ,Underhill DM.Peptidoglycan recognition by the innate immune system.Nat.Rev.Immunol,2018.18(4):243-254.

[8]陈康康,吕志强.昆虫肽聚糖识别蛋白研究进展.昆虫学报,2014.57(8):969-978.

[9]Valanne S,Wang JH,Ramet M.TheToll signaling pathway.J Immunol,2011,186(2):649-656.

[10]刘甜,罗开珺.果蝇Toll和IMD信号通路中的功能结构域.环境昆虫学报,2011,33(3):388-395.

[11]Yoshida H,Kinoshita K,Ashida M.Purification of a pepti doglycan recognition protein from hemolymph of the silkworm,.J Biol Chem,1996,271(23):13854-13860.

[12]Dziarski R,Gupta D.he peptidoglycan recognition proteins (PGRPs).Genome Biol,2006,7(8):232.

[13]Lemaitre B,Hoffmann J.The host defense of.Annu Rev Immunol,2007,25(1):697-743.

[14]许平震.昆虫先天免疫的肽聚糖识别蛋白的研究进展.安徽农业科学,2011,39(23):82-84+88.

[15]Tanaka H.A genome-wide analysis of genes and gene families involved in innate immunity of.Insect Biochem Mol Biol,2008,38(12):1087-1110.

[16]许平震.家蚕模式识别受体PGRP､βGRP编码基因的克隆鉴定及表达谱分析蚕业科学,2010,36(3):14-21.

[17]Chen K.A short-type peptidoglycan recognition protein from the silkworm:expression,characterization and involvement in the prophenoloxidase activation pathway.Dev Comp I mmunol,2014.45(1):1-9.

[18]陈康康.家蚕中肠免疫转录组分析及家蚕肽聚糖识别蛋白-S5的功能研究.2016,西北农林科技大学.

[19]Yang PJ.Molecular cloning and characterization of a short peptidoglycan recognition protein from silkworm.Insect Mol Biol,2017.26(6):665-676.

[20]Tanaka H,Sagisaka A.Involvement of Peptidoglycan Recognition Protein L6 in Activation of Immune Deficiency Pathway in the Immune Responsive Silkworm Cells.Arch.Insect Biochem.Physiol,2016.92(2):143-156.

[21]Zhan MY,Yang PJ,Rao XJ.Molecular cloning and analys is of PGRP-L1 and IMD from silkworm.Comp.Biochem.Phys.B,2018.215:19-30.

[22]Gao K.Cloning and expression analysis of a peptidoglyc an recognition protein in silkworm related to virus infection.Gene,2014.552(1):24-31.

[23]Yang J.Peptidoglycan recognition protein S2 from silkworm integument:characterization,microbe-induced expression,and involvement in the immune-deficiency pathway.J Insect Sci,2015.15(1):20.

[24]李建琴,顾国达.“一带一路”对中国蚕丝业发展的战略意义[J].中国蚕业,2015,36(4):1-7.

[25]张晴,周振亚,罗其友.我国桑蚕业发展现状及对策[J].农业经济问题,2008,000(001):18-21.

[26]Jang IH.A Spatzle-processing enzyme required for toll signaling activation in Drosophila innate immunity.Dev Cell,2006.10(1):45-55.

[27]Costechareyre D.Tissue-Specific Regulation of Drosophila NF-kappa B Pathway Activation by Peptidoglycan Reco gnition Protein SC.J Innate Immun,2016.8(1):67-80.

[28]Zhan MY,Yang PJ,Rao XJ.Cloning and analysis of pept idoglycan recognition protein-LC and immune deficiency from the diamondback moth,.Arch.Insect Biochem.Physiol,2018.97(2):e21436.

国家自然科学基金项目（No：31501898），广东省自然科学基金项目（No：2017A030313152），广州大学全日制研究生“基础创新”项目（No：2017GDJC-M28，2018GDJC-M25）。

王涛（1994- ），女，汉族，河南安阳人，硕士，研究方向：昆虫生理生化与分子生物学。

刘吉升，男，副教授。

S881.2

A

2095-1205(2019)11-16-03

10.3969/j.issn.2095-1205.2019.11.08