赵优萍，肖金妮，孙卢狄，蔡成岗，2，3，沙如意，2，3，方晟，毛建卫，2，3，*

（1.浙江科技学院生物与化学工程学院，浙江杭州310023；2.浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心，浙江杭州310023；3.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，浙江杭州310023；4.绍兴文理学院元培学院，浙江绍兴312000）

紫苏是一种药食两用的唇形科紫苏属草本植物，原产于中国，种植面十分广泛。紫苏籽是紫苏的种子，含油量45%～55%[1]。紫苏籽油的不饱和脂肪酸含量达90%，其中含58.48%～76.18%的亚麻酸、8.53%～13.02%的亚油酸、11.42%～23.06%的油酸以及少许的棕榈酸、硬脂酸等[2-4]。近些年来，随着科技的发展和可用资源的稀缺，国内外对紫苏籽油进行了深入研究，不少紫苏籽油产品已投入市场，市场反馈良好。紫苏籽油不仅提供了人体必需的脂肪酸，同时因其具有抗衰老、抗癌、促进大脑发育、增强记忆力、保护视力、降血脂等功效[5-8]，也被视为一款保健品，市场前景十分广泛。

目前，紫苏籽油提取工艺有机械压榨法、溶剂浸提法、超临界CO2萃取法和亚临界萃取法等[9-13]。在新型提取方式方面，马娜等[14]对紫苏籽油不同提取方法的比较研究发现，利用超声波辅助超临界CO2提取紫苏籽油中总脂肪含量为46.90%，不饱和脂肪酸占总脂肪酸的39%，α-亚麻酸占不饱和脂肪酸的61.57%。彭维等[15]研究了超临界和亚临界萃取方法提取紫苏籽油的工艺，出油率分别是39.7%和40.1%，且发现超临界萃取紫苏籽油的理化性质较好。传统提取方法一般为机械压榨法和溶剂提取法，溶剂浸提法的出油率最高，但溶剂残留严重；机械压榨法工艺简单，易于流水线生产，应用较广，分为热榨法和冷榨法，热榨过程中高温容易使α-亚麻酸等有效成分损失。因此在本文中研究两种冷榨法——螺旋压榨法和液压法对紫苏籽油提取的影响，与传统有机溶剂浸提法进行比较，并对其理化性质以及抗氧化性等进行分析，旨在通过对比不同提取方法对紫苏籽油提取率及品质的影响，为紫苏籽油及其他功能油脂的深入开发和利用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫苏籽：浙江科技学院重点实验室花圃；中级初榨橄榄油：北京市品利食品有限公司；双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺 [bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide，BSTFA]-三甲基氯硅烷（trimethylchlorosilane，TMCS）（体积比99∶1）为色谱纯：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

RE-2000A型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；UV-5500PC型紫外分光光度仪：上海元析仪器有限公司；DFT-100型药用粉碎机：温岭市林大机械有限公司；DSH-50A-1型水分测定仪：上海佑科仪器仪表有限公司；DD85G型螺旋压榨机：德国KOMET公司；QYZ-550型液压榨油机：泰安市良君益友机械有限公司；Allegin X-12R台式大容量冷冻离心机：杭州合众生物科技有限公司；7890A-5975C型气相-质谱联用仪 （gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）：郑州中谱仪器设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 紫苏籽油的提取

1.2.1.1 螺旋压榨法

其工艺流程：紫苏籽→70℃干燥2 h→压榨→过滤→粗紫苏籽油[16]。安装压榨机加热套，设定温度为90℃，预热15 min后取下加热套并关闭加热开关，加入70℃烘干的紫苏籽进行压榨，将压榨所得毛油经过滤离心，得到粗紫苏籽油，储存于4℃冰箱中待用，并计算出油率。

1.2.1.2 液压压榨法

其工艺流程：紫苏籽→70℃干燥2 h→压榨→粗紫苏籽油，压榨前液压机60℃预热0.5 h，加入物料后进行60℃压榨，压力由0 MPa升至60 MPa后持续压榨1 h[16]。收集紫苏籽油储存于4℃冰箱中待用，并计算出油率。

1.2.1.3 正己烷浸提法

使用正己烷作为溶剂在索氏提取器内浸提紫苏籽油。其操作步骤为：紫苏籽→70℃干燥2 h→粉碎→正己烷浸提6 h→瓶底溶剂回收→旋转蒸发→粗紫苏籽油。

紫苏籽的出油率按公式1计算：

式中：m1为紫苏籽油的质量，g；m2为紫苏籽的质量，g。

1.2.2 紫苏籽油理化特性检测

酸值测定参考GB 5009.229-2016《食品安全国家标准食品中酸价的测定》[17]；过氧化值测定参考GB 5009.227-2016《食品安全国家标准食品中过氧化值的测定》[18]；碘值测定参考GB/T 5532-2008《动植物油脂碘值的测定》[19]；皂化值测定参考GB/T 5534-2008《动植物油脂皂化值的测定》[20]；水分及挥发物含量测定参考GB 5009.236-2016《食品安全国家标准动植物油脂水分及挥发物的测定》[21]；透明度、气味、滋味测定参考GB/T 5525-2008《植物油脂透明度、气味、滋味鉴定法》[22]。

1.2.3 紫苏籽油脂肪酸组成的测定

硅烷化：称取样品油脂0.2 g～0.3 g于50 mL离心管中，加入2 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液6 mL混匀，25℃下超声提取10 min，取出后于60℃烘箱中皂化1 h。取出漩涡混合2 min，冷却至25℃。加入4 mL水和6 mL正己烷，漩涡混合提取5 min，4 500 r/min离心10 min，转移上层有机相至玻璃试管中，加入1.5 g无水硫酸钠，静置至澄清透明。转移全部上清液于15 mL具塞玻璃离心管中，25℃下氮气吹干。加入200 μL硅烷化试剂BSTFA-TMCS（体积比为99∶1），密封后于70℃烘箱中反应30 min，再加入1 mL正己烷溶解，用0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液作为待测溶液。

色谱条件：HP-5MS（30 m×0.25 μm）毛细管柱；升温程序：柱子初始温度100℃，保持1 min；以5℃/min升至200℃，保持2 min；再以3℃/min升至280℃，保持3 min；载气为高纯氦；进样方式为分流进样，分流比1 ∶50；进样量为 1 μL。

质谱条件：电离方式为电子轰击离子源（EI源）；电子能量70eV；传输线温度280℃；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；溶剂延迟2.6 min；全扫描模式（SCAN），扫描范围 50 u～1000 u；NIST 谱库。

1.2.4 紫苏籽油抗氧化性的测定

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力

取一定体积紫苏籽油于10 mL离心管中，加乙酸乙酯至1mL，加120μmol/LDPPH-乙酸乙酯溶液4mL。混匀静置30 min后用乙酸乙酯做参照，在517 nm下测定其吸光度Ai，同时测定DPPH-乙酸乙酯溶液与1 mL乙酸乙酯混合液的吸光度A0以及一定紫苏籽油加乙酸乙酯至5 mL的混合液吸光度B[23-24]。以橄榄油为对照，根据式（2）计算清除率：

式中：Ai为加紫苏籽油反应后DPPH溶液的吸光度；A0为不加紫苏籽油，只加DPPH溶液的吸光度；B为不加DPPH溶液时，紫苏籽油在517 nm波长下的吸光度。

1.2.4.2 羟基自由基清除能力

查阅文献得知，测定羟基自由基清除率的方法有：电子自旋共振法、高效液相色谱层析法、化学发光法、氧化褪色光度法、自动电位滴定法和极谱法等[25-30]。本试验采用化学发光法对紫苏籽油的羟基自由基含量进行测定。

配置不同浓度的样品液，取一定体积梯度的牡丹籽油溶于1mL无水乙醇中，混匀，充分溶解，10000r/min离心10 min，取上清液100 μL于10 mL试管中，加入5 mL无水乙醇，充分混匀，待测。

在10 mL试管中依次加入磷酸盐缓冲液（pH=7.4）、邻菲罗啉乙醇溶液、去离子水、FeSO4溶液（0.75 mmol/L），加入双氧水（0.01%）和牡丹籽油样品液启动Fenton反应。按表1顺序加入各溶液。

表1 加入溶液的种类和体积Table 1 The type and volume of added solution

反应体系置于37℃恒温水浴中，反应3 h，反应完全后立即取出并测定其在536 nm处的吸光度，以去离子水为参比。以橄榄油为对照，按式（3）计算羟基自由基的清除率：

式中：Ai为紫苏籽油样品液的吸光度；A0为不含样品液和双氧水的吸光度；B为只含双氧水的吸光度。

1.3 数据分析

试验数据表示为Mean±SD，采用SPSS 17.0数据统计软件和Origin 8.6软件对试验数据进行数据处理和分析，并采用Duncan’smultiple rang test进行组间显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同方法提取紫苏籽油的出油率比较

试验测试不同方法对紫苏籽出油率的影响，结果见表2。

表2 不同提取方法对紫苏籽出油率的影响Table 2 Effects of different methods on perilla seed oil extraction rate

由表2可知，紫苏籽采用正己烷浸提法的出油率为（27.93±1.50）%，高于液压出油率的（20.70±0.42）%和螺旋压榨出油率的（9.66±0.65）%。正己烷浸提紫苏籽经干燥粉碎，且提取时间久，提取比较完全，出油率最高，但其存在溶剂残留等安全问题。按照相同条件处理的原料，原料颗粒度小，含水量7.5%左右，两种冷榨法相比较，液压法出油率远高于螺旋压榨法，更有利于紫苏籽油的提取。

2.2 不同方法提取紫苏籽油理化特性比较

不同提取方法对紫苏籽油理化特性的影响见表3。

表3 不同提取方法对紫苏籽油的理化特性的影响Table 3 Effects of different extraction methods on physicochemical properties of perilla seed oil

两种压榨紫苏籽油中水分及挥发物含量较低，有利于油脂的长期保存，而在正己烷浸提紫苏籽油中较高，极可能是溶剂残留。3种提取方式得到的油脂中，正己烷浸提油脂的酸值最高，表明其游离脂肪酸含量较高，易被氧化。液压提取油脂的酸值最低，仅为（0.46±0.12）mgKOH/g，符合食用植物油卫生标准（植物原油酸值＜4.0 mgKOH/g）。过氧化值是评判油脂氧化程度的指标之一，3个油样中浸提油脂的过氧化值最高，其次是螺旋压榨油脂，最低的为液压油脂，表明液压油脂的被氧化酸败程度较低。3种紫苏籽油的碘值差异不显著，均大于130 gI2/100 g，表明其不饱和脂肪酸含量很高，属于干性油脂。正己烷浸提紫苏籽油的皂化值较高，螺旋压榨和液压紫苏籽油相对较低，表明浸提紫苏籽油中脂肪酸分子质量大于两种压榨紫苏籽油。螺旋压榨法所得紫苏籽油略有混浊，是由压榨过程中混入细微物料过滤不彻底造成。两种压榨紫苏籽油均具有紫苏籽油特有气味，而正己烷浸提法所得紫苏籽油香味较淡，可能是由于索式提取过程中挥发性物质的损失所致。

2.3 不同方法提取紫苏籽油的脂肪酸组成分析

分别将3种紫苏籽油用气相色谱-质谱联用仪进行分析鉴定，得到其总离子流图谱，进一步利用NIST98标准谱库检索，并结合有关文献进行人工谱图解析，确定了3种紫苏籽油的主要脂肪酸组成，并采用峰面积归一化法计算得到各组分的相对含量，结果见表4。

表4 不同提取方法所得紫苏籽油脂肪酸组成Table 4 Composition of perilla seed oil extracted by screw press method%

由表4可知，紫苏籽油主要含5种脂肪酸，即棕榈酸、油酸、亚麻酸、亚油酸、硬脂酸。3种提取方式制得紫苏籽油中，液压油脂中亚麻酸相对含量最高，占总脂肪酸的（68.84±0.07）%，螺旋压榨和液压油脂中亚麻酸含量无显著性差异，分别为（57.20±0.57）%和（57.04±1.77）%。3种油脂不饱和脂肪酸占总脂肪酸含量有显著差异（p＜0.01），液压紫苏籽油（89.00%）＞螺旋压榨紫苏籽油（83.00%）＞正己烷浸提紫苏籽油（77.00%）。

2.4 不同方法提取紫苏籽油抗氧化性分析

2.4.1 DPPH自由基清除能力

不同提取方法制得的紫苏籽油对DPPH自由基的清除能力见图1。

图1 紫苏籽油对DPPH自由基清除作用的体积浓度-效应关系Fig.1 Volume concentration effect relationship of perilla seed oil on scavenging DPPH radical

3种紫苏籽油和橄榄油对DPPH自由基的清除率均随着油脂体积浓度的增大先升高而后趋于平稳。当紫苏籽油体积浓度达到32 μL/mL时，3种紫苏籽油对DPPH自由基的清除率均达到最大值，接近95%。IC50表示达到最大清除率一半时的底物用量，与物质的抗氧化性能成反比，IC50值越小，说明其抗氧化性能越强。螺旋压榨法、液压法和正己烷浸提法所得紫苏籽油清除DPPH自由基的IC50值分别为6.37、10.33、12.13 μL/mL，橄榄油则为13.97 μL/mL，表明紫苏籽油的抗氧化性显著高于橄榄油，其中，螺旋压榨油脂的抗氧化性高于液压和正己烷浸提油脂，说明螺旋压榨法保留了紫苏籽油中更多的抗氧化成分。

2.4.2 羟基自由基清除能力

羟基自由基清除率是反应油脂抗氧化作用的重要指标之一。图2为不同紫苏籽油对羟基自由基的清除能力。

图2 紫苏籽油对羟基自由基清除作用的体积浓度-效应关系Fig.2 Volume concentration effect relationship of the effect of perilla seed oil on hydroxyl radical scavenging

由图2可知，3种紫苏籽油对羟基自由基的清除能力远大于橄榄油。随着油脂体积浓度的增加，其对羟基自由基的清除能力急剧升高，达一定浓度后趋于稳定。在 1.0 μL/mL～2.0 μL/mL 阶段，螺旋压榨紫苏籽油对羟基自由基的清除率远高于其他油脂。在体积浓度大于2.0 μL/mL后，3种紫苏籽油的清除能力逐渐接近，并达到最大值。螺旋压榨法、液压法、正己烷浸提法所得紫苏籽油和橄榄油对清除羟基自由基的IC50值分别为 0.996、2.13、1.88、5.72 μL/mL，表明螺旋压榨油脂清除自由基的能力更强。

3 结论

本研究中3种不同提取方法对紫苏籽油提取的影响均存在显著差异，正己烷浸提法出油率最高，为（27.93±1.50）%，但液压法（20.70±0.42）%和螺旋压榨法（9.66±0.65）%更加绿色安全，无溶剂残留等问题。液压法的出油率远高于螺旋压榨法，且制得油脂的酸值和过氧化值均小于其他两种油脂，皂化值和碘值等无显著性差异，更有利于紫苏籽油的提取。通过脂肪酸分析，液压紫苏籽油中亚麻酸相对含量高达（68.84±0.07）%，高于螺旋压榨油脂的（57.20±0.57）%和正己烷浸提油脂的（57.04±1.77）%。在体外抗氧化活性方面，螺旋压榨紫苏籽油对DPPH自由基和羟基自由基的清除能力均高于其他两种油脂。