赵旭，赵艳，刘玉梅，王浩

（新疆大学 化学化工学院，乌鲁木齐 830046）

烤制食品尽管香气诱人，但在加工过程中温度较高，可能会发生一系列的化学反应，导致维生素、氨基酸、蛋白质的损失或破坏，甚至可能产生亚硝胺、苯并芘等潜在的致癌物［1－3］。香辛料是指一类有芳香和辛香等典型风味的调味料，除具有增强食品香味、防腐抑菌等作用外，香辛料在食品加工中的一些特殊功效逐渐被发现，尤其是其抗氧化活性及抑制或减少肉制品加工过程中的危害物产生的作用更是被广泛关注［4，5］。研究表明，同样爱好烧烤食品的地中海地区人群的心脑血管疾病的发病率很低，就与他们饮食中大量摄入香辛料有关［6］。

孜然、洋葱是新疆特色美食烤羊肉不可或缺的香辛料，而辣椒也是烤羊肉时的重要调味料［7］。孜然（Cuminum cyminumL.），又名枯茗、孜然芹，维吾尔医药认为其具有醒脑通脉、降火平肝等功效，能祛寒除湿、理气开胃、祛风止痛［8，9］。洋葱的营养成分十分丰富，不仅富含钾、维生素C、叶酸、锌、硒及纤维质等营养素，其重要的黄酮类物质——槲皮素和前列腺素A，令洋葱具有很强的抗氧化作用［10，11］。与其相配伍的辣椒，维生素B、维生素C和叶酸等含量丰富，辣椒素和辣椒碱还具有抗炎及抗氧化作用，对降低心脏病、肿瘤及其他饮食相关的慢性病发病风险有积极的作用［12，13］。

本文拟通过考察上述3种调味料经不同温度处理后其总酚、总黄酮和清除自由基活性的变化，研究上述调味料间抗氧化活性的协同作用，以揭示它们在抑制烤羊肉加工过程中因高温烧烤而诱导的一系列不利于健康的反应方面所发生的积极作用。

1 材料与仪器设备

1.1 材料与试剂

孜然、辣椒和新鲜洋葱：均购自超市购买，其中孜然和辣椒为干品，试验前粉碎后过40目筛备用；新鲜洋葱试验前剥去最外层的干皮，用打浆机搅拌成浆液备用。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazly，简称 DPPH）和福林-酚试液：购于Sigma-Aldrich公司；原花青素标准品、没食子酸和芦丁：购于中国食品药品检定研究院；硫代巴比妥酸（TBA）、三氯乙酸（TCA）、邻二氮菲、碳酸钠、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、双氧水、磷酸盐缓冲溶液、硫酸亚铁、无水乙醇、甲醇等：均为分析纯，购于化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

BS210S型电子天平 德国赛多利斯公司（读数精度：0.1mg）；电热恒温培养箱 北京市永光明医疗仪器厂；UV-5300PC型紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；TGL16G型离心机 上海安亭科学仪器厂。

2 试验方法

2.1 样品制备

2.1.1 单组分提取液的制备

准确称取3.0000g孜然粉（或3.0000g辣椒粉、15.0000g洋葱浆液）于100mL小烧杯中，置于预升温的烘箱中，分别于100，120，140，160，180，200℃烘烤20min，取出降至室温，用移液管准确加入50mL 75%的乙醇，在搅拌下于70℃的水浴中提取20min，然后超声提取10min。提取完成后，将提取液抽滤，并用75%的乙醇溶液30mL洗涤滤渣，然后转移至100mL的容量瓶中，抽滤瓶用少量75%的乙醇润洗后与滤液合并，最后用75%的乙醇溶液定容至刻度，备用。所有试验均平行处理3次。

2.1.2 两组分提取液的制备

称取3.0000g孜然粉和15.0000g洋葱浆液于100mL小烧杯中，混合均匀，后续烘烤、提取等处理步骤同2.1.1。

2.1.3 三组分提取液的制备

准称3.0000g孜然粉、3.0000g辣椒粉和15.0000g洋葱浆液于100mL小烧杯中，混合均匀，后续烘烤、提取等处理步骤同2.1.1。

2.2 抗氧化活性的评价

2.2.1 总黄酮的测定

芦丁标准曲线的制备：黄酮类化合物在碱性条件下与铝盐（三氯化铝或硝酸铝）络合可呈现红色络合物，基于此原理可通过测定反应体系在510nm处的吸光度值来确定黄酮的含量［14］。准称105℃干燥至恒重的芦丁标准品109.1mg于100mL容量瓶中，加入体积分数为60%的乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，此为标准储备液。准确移取此标准储备液10mL于50mL容量瓶中，加入体积分数为30%的乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，此为标准母液（含芦丁0.218mg／mL）。准确移取上述标准母液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL分别置于25mL容量瓶中，分别加入1mL 5%的NaNO2溶液，并补加30%乙醇至溶液体积均为10mL，避 光 保 存1h。再 分 别 加 入1mL 10% 的Al（NO3）3，混匀，放置6min；再分别加入10mL 1mol／L的NaOH溶液，并用蒸馏水定容至刻度；摇匀后，静置反应15min。以不加标准样品的溶液同上述步骤制备参比，在λ＝510nm处测定吸光度值（A510）。以吸光度值对应芦丁质量浓度进行线性回归，得到标准曲线。

样品中总黄酮的测定：将上述步骤中加入的1.0mL标准溶液改为1.0mL样品溶液，其余测定步骤同上，获得样品溶液的吸光度值，根据标准曲线计算样品中总黄酮的浓度。

总黄酮含量（mg／g）＝测定样品浓度（mg／L）×提取液体积（L）×稀释倍数／样品质量（g）。

2.2.2 总多酚含量的测定

没食子酸标准曲线的制备：以105℃干燥至恒重的没食子酸为标准品，采用福林-酚比色法（Folin-Ciocalteu）测定［15］。准称44.3mg的没食子酸标准品于100mL容量瓶中，用蒸馏水溶解并定容至刻度，摇匀，此为标准储备液。以此溶液分别配制浓度为8.86，17.72，35.44，70.88，88.60，106.32mg／L 的系列标准溶液。分别移取1mL上述系列标准溶液于10mL容量瓶中，依次加入1mL去离子水、0.5mL已用去离子水稀释2倍的福林-酚试剂，摇匀，静置5min；再分别加入1.5mL 20%的Na2CO3溶液，用去离子水定容至刻度，混匀后在室温下避光反应2h。在λ＝760nm处测其吸光度值（A760），以吸光度值对应没食子酸质量浓度进行线性回归，得到总多酚测定的标准曲线。

样品中总多酚的测定：将上述测定步骤中加入的1mL标准溶液改为1mL样品溶液，即可得到样品溶液的吸光度值，根据标准曲线可计算样品中的总多酚含量。

总多酚含量（mg／g）＝测定样品浓度（mg／L）×提取液体积（L）×稀释倍数／样品质量（g）。

2.2.3 总花青素含量的测定

采用直接紫外分光光度法测定。花青素、原花青素类物质在280nm处有特征吸收峰，用已知含量的原花青素作对照品根据标准曲线可计算样品中原花青素的含量［16］。

原花青素对照品标准曲线的制备：准确称取原花青素标准品5mg，用75%的乙醇溶解，定容至10mL容量瓶中，此为标准储备液。准确吸取此标准储备液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2mL，分别置于10mL容量瓶中，用75%乙醇定容至刻度，摇匀。用石英比色皿在波长280nm下测定其吸光度值，以75%乙醇为参比，得标准曲线。

样品中总花青素含量的测定：根据样品提取液的浓度确定在标准曲线线性范围内的稀释倍数，取稀释后的样品溶液，以75%乙醇为参比，用石英比色皿在波长280nm下测定其吸光度值，根据标准曲线计算测试样品中原花青素的含量，并换算出样品中的含量。

样品总花青素含量（mg／g）＝测定样品浓度（mg／L）×提取液体积（L）×稀释倍数／样品质量（g）。

2.2.4 清除DPPH·自由基活性评价

二苯基苦基苯肼（DPPH）是一种很稳定的以氮为中心的自由基，其甲醇溶液呈深紫色，在517nm处有强吸收，体系中抗氧化物质可将其单电子配对，在517nm处吸收峰会下降或消失，据此可测定样品对DPPH·的清除效果，评价样品的抗氧化能力。用甲醇配制成0.04mg／mL的DPPH标准溶液。准确移取1mL质量浓度在0.02～4.00mg／mL的样品于试管中，加入DPPH溶液3mL，充分混匀，放置40min。在517nm处测其吸光度值A样。采用1mL甲醇溶液代替上述样品液，测得空白组的吸光度值A控。实验中为减少因样品色差可能带来的误差，采用1mL相应的样品溶于3mL甲醇的溶液作参比A参。DPPH·自由基的清除率计算公式如下：

DPPH·自由基清除率E＝［1－（A样－A参）／A控］×100%。

2.2.5 清除羟基自由基（·OH 邻二氮菲-Fe2＋）活性评价

采用邻二氮菲-二价铁氧化法。Fenton反应可以使 H2O2－Fe2＋体系产生羟基自由基，H2O2－Fe2＋水溶液被羟基自由基氧化为邻二氮菲-Fe3＋，反应后其在536nm处的最大吸收峰消失，据此可推算体系中羟基自由基的变化。准称1.4867g邻二氮菲，用100mL无水乙醇配制成0.075mol／L邻二氮菲醇溶液，使用前用重蒸水稀释100倍。取1mL样品于20mL试管中，依次加入1mL 0.75mmol／L邻二氮菲，pH 为7.4的0.2mmol／L磷 酸 盐 缓 冲 溶 液 2mL，浓 度 为0.75mmol／L FeSO4溶液1mL，充分摇匀，置于37℃保温箱中保温1h。取出后冷却，以重蒸水作空白，测其在536nm波长下的吸光度值A样。以1mL 0.1%的H2O2代替上述步骤中的1mL样品，可测得损伤管吸光度值A损；用2mL重蒸水分别代替前述步骤中的1mL样品和1mL H2O2，可测得未损伤管的吸光度值A未。羟基自由基的清除率计算公式如下：

羟基自由基的清除率E（%）＝［（A样－ A损）／［A未－A损］×100%。

2.2.6 抑制脂质过氧化活性评价

Fe2＋可诱导脂蛋白发生过氧化反应，使多不饱和脂肪酸（PUFA）氧化为有害产物丙二醛（MDA）［17］。当有硫酸亚铁存在时，体系中的蛋黄脂质经历快速非酶过氧化反应，显色剂硫代巴比妥酸（TBA）与过氧化产物丙二醛MDA的复合物TBA-MDA呈现明显粉红色，在532nm处有最大吸收峰，故可用于评价调味料抑制脂质过氧化的能力，通过测定在532nm处吸光值的变化来确定样品对脂质过氧化的抑制率。准确移取1mL卵黄悬液（1∶25，V／V）到具塞的10mL玻璃试管中，再分别移取1mL 样液、1mL 25mmol／L FeSO4溶液和1mL pH为4.7的0.1mol／L 磷酸缓冲溶液，培养箱37℃保温20min，再依次加入1mL TCA、1mL TBA，在532nm处测得吸光度为A样。将1mL样液替换成1mL上述磷酸缓冲溶液，测得吸光度为A空白。

脂质过氧化抑制率E＝［（A空白－A样）／A空白］×100%。

2.2.7 抗氧化协同系数（SE）的计算方法

抗氧化协同系数SE为各体系实验得到的清除率ESC和理论计算的清除率TSC之间的比值［18］，即SE＝ESC／TSC。当SE＞1时表示有协同作用；当SE＜1时表示无协同作用。

因测试体系的样品组成不同，理论清除能力（TSC）的计算公式如下：

式中：ESC1，……，ESCn分别是单一样品清除率的实验值，n代表体系中组分数量。

2.3 统计分析

所有试验均采用3次重复，试验数据的处理及统计分析结果均采用 Microsoft Excel 2010或 Origin Pro 9.0专业软件来处理，试验数据均用平均值±标准偏差表示（n≥3）。

3 结果与分析

3.1 标准曲线回归方程的建立

大量研究表明，多酚和黄酮类物质在自然界分布广泛，且大多具有非常强的抗氧化活性，是人们自饮食摄入最多的抗氧化物质，总多酚和总黄酮的含量高低与抗氧化活性的强弱有明显的相关性［19］。测定总黄酮和总多酚的标准曲线见图1。

图1 标准曲线及线性回归方程Fig.1 Standard curves and linear regression equations

3.2 未经烤制样品分析

新疆烤羊肉加工时，除食盐外，孜然为必备的调味料。此外多数情况下，羊肉在烤制前会预先伴入洋葱进行短时间的腌制，而辣椒往往是根据顾客的喜好在烤制后期添加。为了尽可能地模拟上述3种条件，试验除研究了对上述3种调味料分别单独进行不同温度的烘烤外，还分别研究了对孜然和洋葱的二组分体系和对孜然、辣椒、洋葱的三组分体系在不同温度烤制后的总黄酮、总多酚、花青素含量及抗氧化活性随温度的变化趋势，并以未经烤制的样品作对照。未经烘烤处理的样品中的各活性成分含量和抗氧化活性的评价结果见表1。

表1 未经烤制样品的活性成分含量及抗氧化活性Table1 The content of active components and antioxidant activity of unbaked samples

3.3 不同温度下单组分提取液的总黄酮、总多酚和花青素含量

为了评价烘烤温度是否会对孜然、洋葱、辣椒等香辛料中的黄酮、多酚和花青素含量产生影响，在设定的温度下将样品单独烘烤20min后测定了样品中黄酮、多酚和花青素含量的变化，结果见图2。

图2 不同温度下孜然、洋葱、辣椒的挥发性成分分析Fig.2 Analysis of volatile constituents of cumin，onion and chili at different temperatures

由图2可知，经过高温烘烤处理，对3个样品中的多酚、黄酮类物质的含量均会产生影响［20］。在3个样品中，孜然的黄酮、多酚和花青素含量均最高，其次为洋葱，辣椒中的含量均最低。与表1中未烘烤的样品相比较，经过不同温度处理均比未经烘烤的样品中黄酮、多酚、花青素含量提高，但当温度升高到160℃或更高时，除洋葱中的花青素含量外，其他组分样品的黄酮、多酚和花青素含量随温度的升高呈先增大后下降的趋势。这说明适当的加热处理后，样品中的黄酮、多酚和花青素类成分会释放而更容易被提取。

3.4 单组分清除DPPH·、·OH自由基和抑制脂质过氧化的能力评价

羟基自由基是对细胞损伤最大、反应性最强的活性氧自由基，可对蛋白质、氨基酸、核酸、糖类和脂类等造成氧化损伤，引起细胞突变或坏死［21］。在体外实验体系中，·OH、DPPH·的清除能力和抑制脂质过氧化的能力是评价体系抗氧化能力强弱的重要方法。由于各样品的抗氧化活性的浓度差异较大，为了方便比较和评价样品的协同抗氧化活性，首先通过预试验确定对应样品的最适抗氧化体系的浓度范围，评价抗氧化活性的样品浓度是以各组分在不同体系中清除率或抑制率达到50%左右时确定的。经不同温度烘烤处理后的孜然和洋葱样品抗氧化活性的评价曲线见图3。

图3 不同温度下孜然、洋葱和辣椒的抗氧化活性评价Fig.3 Antioxidant activity evaluation of cumin，onion and chili at different temperatures

由图3中A可知，在清除DPPH·体系中，孜然的清除能力随温度增高而上升，在140℃时达到最高值，后随温度增高而下降；洋葱清除DPPH·的能力随温度增高缓慢上升，最高值与最低值的变化小于11%；辣椒清除DPPH·能力变化较大，随温度增高而上升，在160℃达到最高值，后随温度增高而快速下降。由图3中B和图3中C可知，在清除·OH体系和抑制脂质过氧化评价体系中，3种调味料的清除能力均随温度的增高而上升，当达到最大值后随温度的升高而下降，其中孜然、洋葱清除·OH的能力均在140℃时达到最高，而辣椒在160℃时清除率最大，而孜然、洋葱和辣椒抑制脂质过氧化的能力分别在180，140，160℃达到最大。结果表明：3种样品均具有一定的抗氧化活性，这与3种调味料中多酚、黄酮和花青素的含量有关［22］。与未经温度烤制的样品相比，DPPH·体系中孜然在较低温区清除能力较强，温度大于140℃时其清除能力比未经烤制的样品低，其余所有体系经温度处理样品的抗氧化能力均比未经温度烤制的样品高，这与烘烤处理后体系中多酚、黄酮、花青素的含量增加基本一致，说明适当的加热处理对样品的活性成分的释放有利，但温度过高则不利。

3.5 复配组分的协同抗氧化活性评价

调味料是天然抗氧化剂的丰富来源，因其所含的植物化学物质组成多样，已在很多食品中除被作为风味调控剂外，也被用作抗氧化剂或抑菌剂，进而发展成为控制食物中脂质过氧化的方法［23］。为了进一步比较上述3种调味料间的协同抗氧化活性，试验中充分参考了人们在日常饮食中对辣味有不同爱好的特点，比较了孜然、洋葱二组分调味料混合烘烤和孜然、洋葱、辣椒三组分调味料混合烘烤时，复配体系样品中总黄酮、总多酚、花青素含量和清除DPPH·、·OH以及抑制脂质过氧化能力的变化，以评价上述3种调味料是否存在抗氧化活性的协同作用，结果见图4。

图4 不同温度下复配体系的含量及抗氧化活性Fig.4 Composition and antioxidant activity of combined system at different temperatures

由图4可知，二组分体系中总黄酮、总多酚和花青素含量随温度增加的持续上升，在温度达到200℃时仍未出现含量下降的趋势；而三组分体系中总黄酮和总多酚均在180℃时达最高，花青素含量则随温度的提高在不断增加。与未经处理的样品比较，除黄酮外，未经烤制样品的多酚花青素均比温度处理后的含量低。在抗氧化评价体系中，除二组分体系清除DPPH·的活性随温度的升高持续增加外，其余评价体系中样品的活性均与三组分体系中总黄酮和总多酚含量的变化趋势相似，抗氧化活性均在180℃达到最大值。与未经处理的样品比较，在180℃左右，经温度处理样品的抗氧化活性较高，其他温度区间的抗氧化活性均低于此处理。

3.6 抗氧化协同系数（SE）的计算

为评价2个或2个以上的组分是否存在抗氧化协同作用，协同系数（SE）可用来衡量复合体系协同增效作用的大小。二组分和三组分体系的抗氧化活性的协同系数见表2。

由表2可知，无论是二组分复配和三组分复配体系其协同系数均小于1，即在各种温度条件下，上述3种调味料均表现为无协同抗氧化作用。未经温度处理样品的协同系数也均小于1，故无协同抗氧化作用。

表2 复配体系的协同系数Table2 The synergistic effect（SE）of combined system

4 结论

文章比较了孜然、洋葱和辣椒3种调味料的单组分、二组分、三组分样品经不同温度处理后总黄酮、总多酚和总花青素含量变化，以及清除DPPH·、·OH及抑制脂质过氧化活性的变化，并比较了其抗氧化活性的协同作用。结果表明：孜然的总黄酮、总多酚、总花青素含量最大。经100～200℃烘烤20min后，3种调味料样品均具有一定程度的清除自由基和抑制抗氧化作用的活性，且孜然、洋葱二组分复配体系和孜然、洋葱、辣椒三组分复配体系也均具有抗氧化活性。通过协同系数的计算发现，所有复配体系中均无抗氧化协同作用，且温度大于180℃时，其抗氧化活性逐渐降低，较适宜的烘烤温度范围为140～180℃之间。上述研究可为揭示新疆传统饮食搭配中的科学问题以及为更好地发展新疆的饮食文化提供借鉴和参考。此外，新疆传统烤制食品调味料的用量比例、抗氧化机理以及样品在烘烤前后混合体系中总黄酮、总多酚和花青素含量明显下降的原因等在后续研究中都还有待深入的探究。