罗永锋，李 蓉，王 强，姚 杨

作者单位:1(467100)中国河南省郏县光明眼科医院;(710077)中国陕西省西安市，西安医学院第一附属医院 2眼科;3感染控制科;4中心实验室

0 引言

细胞自噬是一种普遍存在于真核生物中的溶酶体降解途径，能对损伤的细胞器和毒性蛋白聚合物等细胞内产物进行包裹、消化、降解和再利用，以满足细胞自身的代谢需要以及细胞器的更新［1－2］。自噬在衰老、肿瘤、炎症、神经退行性疾病中起重要作用，故已成为目前生物学领域的研究热点。炎症反应的发生在很大程度上与细胞自噬存在密切关联，其机制涵盖多个方面，并且在眼科疾病中可能发挥重要作用［3］。

视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)是一种具有多种复杂生理生化功能的色素细胞，分泌的多种生长因子可影响神经视网膜细胞及其自身的生理特性，也与眼部疾病的发生密切相关［4］。在正常生理条件下，炎性细胞因子主要由单核巨噬细胞产生，病理条件下神经胶质细胞、RPE细胞等也可分泌［5］。炎性因子 IL－1β和 IL－6具有多种生物功能活性，与机体免疫、各种器官的生理功能有关，目前对于RPE细胞表达IL－1β和IL－6与细胞自噬的关系尚不清楚。LC3、Beclin－1和p62等是参与自噬体或自噬溶酶体形成的关键蛋白，近年来作为自噬标记物被广泛用于相关研究中［6－7］。3－甲基腺嘌呤(3－MA)和氯喹(CQ)是两种应用广泛的自噬抑制剂，分别作用于自噬的早期和晚期阶段。基于此，本研究观察细胞自噬在缺氧条件下RPE细胞表达IL－1β和IL－6中的作用。

1 对象和方法

1.1 对象 ARPE－19细胞系(武汉普诺赛生命科技有限公司);DMEM/F12培养基(美国Gibco公司);3－MA(美国Selleck公司);CQ(美国Sigma公司);兔抗人LC3B多克隆抗体(美国CST公司);兔抗人Beclin－1多克隆抗体(美国CST公司);兔抗人p62多克隆抗体(美国CST公司);兔抗人GAPDH多克隆抗体(杭州贤至生物有限公司);HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司);人IL－1β和IL－6 ELISA试剂盒(欣博盛生物科技有限公司)。三气培养箱(上海力申科学仪器有限公司，HF－100型);倒置相差显微镜(日本Olympus公司，IX51型);全自动酶标仪(美国Thermo scientific公司，Multiskan MK3型)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 用不含EDTA的0.25%胰酶消化ARPE－19细胞，用含10%FBS+1%青霉素和链霉素的DMEM/F12培养基终止消化，轻轻吹打混匀成单细胞悬液，传代至培养皿中，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养。取对数生长期、生长状态良好的细胞(5～10代)接种于6孔板，每孔5×105个细胞。待细胞贴壁后将细胞分为缺氧组、3－MA+缺氧组、CQ+缺氧组、正常对照组，其中缺氧组细胞置于 O2∶CO2∶N2体积比为 1∶5∶94 的培养箱中培养24h;3－MA+缺氧组细胞先用10mmol/L 3－MA预处理2h，然后处理方法同缺氧组;CQ+缺氧组细胞先用50μmol/L CQ预处理2h，然后处理方法同缺氧组。对照组细胞在正常氧条件下培养。

1.2.2 ELISA 所有分组的细胞因子均采用酶联免疫吸附剂测定分析方法(ELISA)进行检测，具体参照说明书进行操作。分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品和样品稀释液100μL，余孔分别加标准品或待测样品100μL。酶标板覆膜，36℃孵育90min。充分洗板后空白孔加入生物素化抗体稀释液，其余孔中加入生物素化抗体工作液100μL，覆膜后36℃温育1h。充分洗板后向空白孔加入酶结合稀释液，其余孔加酶结合物工作液100μL，覆膜后36℃温育30min。洗板后每孔加显色剂(TMB)100μL，酶标板加上覆膜在37℃避光孵育15min，每孔加终止液100μL，终止反应，用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。

1.2.3 Western blot 细胞处理完成之后，弃培养液，预冷PBS漂洗3次，加400μL含PMSF的裂解液使细胞充分裂解，离心提取细胞总蛋白，通过BCA法测定蛋白浓度。30%丙烯酰胺SDS－PAGE凝胶电泳后将蛋白转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭液常温封闭2h;一抗孵育:将膜分别放入稀释好的抗体 LC3B(1∶1000)、Beclin－1(1∶1000)、p62(1∶1000)及 GADPH(1∶1000)中，4℃摇床过夜。用TBST洗膜3次，每次10min;二抗孵育:将膜放入用稀释液稀释好的HRP标记的二抗(1∶50000)中避光常温孵育1～2h。用TBST洗膜3次，每次10min;ECL显色曝光，扫描胶片后使用BandScan系统软件分析蛋白条带。将目的蛋白LC3B、Beclin－1和p62与内参GAPDH灰度的比值作为目的蛋白的相对表达量。实验均在不同时间3次生物学重复。

统计学分析:采用统计软件SPSS20.0对数据进行处理及分析，计量资料以均数±标准差(珋x±s)表示，计量资料均符合正态分布，方差齐，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD－t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ARPE－19细胞形态 培养24h在倒置显微镜下观察，ARPE－19细胞形态呈现扁圆形、梭形、多角形或者不规则形，贴壁良好，胞浆内未见明显黑色素颗粒。不同组之间的细胞形态未见明显差异，见图1。

2.2 各组RPE细胞表达IL－1β及IL－6的浓度比较 IL－1β和IL－6浓度的标准曲线(图2)及相应的浓度方程为:y=(－0.2463+311.0454x)/(1+0.1937x－0.1366x2)，y=(0.9089+117.3496x)/(1－0.4715x+0.0727x2)，获得各组细胞上清液中IL－1β和IL－6的浓度。ELISA结果显示培养的细胞在未受到刺激的情况下仅仅产生少量的IL－1β和IL－6。缺氧刺激之后，上清液中IL－1β和IL－6的产量迅速增加，3－MA或CQ可以明显抑制IL－1β和IL－6的产生(图3)。缺氧组、3－MA+缺氧组、CQ+缺氧组及对照组细胞的 IL－1β 浓度分别为 195.01±5.62、167.80±3.15、131.78±5.38、98.37±5.49pg/mL，总体比较差异有统计学意义(F=211.89，P＜0.01)。两两比较发现，缺氧组的IL－1β浓度明显高于对照组、3－MA+缺氧组和 CQ+缺氧组，差异均有统计学意义(P＜0.01)。缺氧组、3－MA+缺氧组、CQ+缺氧组及对照组细胞的IL－6浓度分别为252.32±12.48、165.45±10.13、90.07±5.37 和 53.13±2.60pg/mL，总体比较差异有统计学意义(F=317.15，P＜0.01)。两两比较发现，缺氧组的IL－6浓度明显高于对照组、3－MA+缺氧组和CQ+缺氧组，差异均有统计学意义(P＜0.01)，见图3。

图1 倒置显微镜下观察ARPE－19细胞形态(×100) A:对照组;B:缺氧组;C:3－MA+缺氧组;D:CQ+缺氧组。

图2 IL－1β及 IL－6的浓度标准曲线 A:IL－1β;B:IL－6。

图3 ELISA检测 IL－1β及IL－6浓度的统计柱状图 A:IL－1β;B:IL－6。bP＜0.01 vs缺氧组。

图4 Western blot检测各组细胞LC3B、Beclin－1和 p62的蛋白条带图。

2.3 各组RPE细胞自噬水平的比较 Western blot实验结果显示，与对照组比较，缺氧组细胞自噬激活，表现为LC3B－Ⅱ/Ⅰ比值、Beclin－1这两种蛋白条带增强和 p62蛋条带减弱。与缺氧组比较，当采用自噬抑制剂3－MA预处理细胞，LC3－Ⅱ/Ⅰ及Beclin－1的表达则明显降低，p62的表达明显升高;采用自噬抑制剂 CQ预处理细胞，Beclin－1的表达明显降低，LC3－Ⅱ/Ⅰ及p62的表达明显升高，见图4。缺氧组、3－MA+缺氧组、CQ+缺氧组及对照组细胞中的LC3B－Ⅱ/Ⅰ、Beclin－1及p62的相对蛋白表达量分别为(0.50±0.05、0.34±0.01、0.67±0.05 和 0.24±0.02)、(0.97±0.05、0.78±0.06、0.54±0.01 和 0.32±0.03)和(0.32±0.10、0.78±0.08、0.96±0.02 和 1.03±0.02)。组间总体比较差异均有统计学意义(LC3B－Ⅱ/Ⅰ:F=80.65，P＜0.01;Beclin－1:F=139.29，P＜0.01;p62:F=70.64，P＜0.01)。之后两两比较发现，缺氧组细胞中LC3B－Ⅱ/Ⅰ和Beclin－1的相对蛋白表达量均明显高于对照组和3－MA+缺氧组，缺氧组中LC3B－Ⅱ/Ⅰ的相对蛋白表达量低于CQ+缺氧组，差异均有统计学意义(P＜0.01)。缺氧组细胞中p62相对蛋白表达量明显低于对照组、3－MA+缺氧组和CQ+缺氧组，差异均有统计学意义(P＜0.01)，见图5。

3 讨论

RPE细胞是一种具有多种复杂生理生化功能的色素细胞，在眼的发育和视觉功能中起着非常重要的作用［8］。在疾病状态下，视网膜细胞的结构和功能会发生改变，其中RPE细胞是病变的中心环节，其结构或功能异常会导致视网膜感光细胞功能受损、视网膜退化等疾病的发生。研究证实，RPE细胞是参与增生性玻璃体视网膜病变、年龄相关性黄斑变性及糖尿病视网膜病变等的主要细胞，它分泌的IL－1β、IL－6等炎性因子在趋化细胞移动、启动细胞增生、分泌胶原和纤维血管膜形成中可能发挥重要作用［9－12］。RPE 受刺激后能分泌 IL－4、IL－6、IL－8、IL－10、干扰素－γ和单核细胞趋化蛋白－1等多种炎性细胞因子［13］。上述眼底疾病的发生与缺氧、慢性炎症密切相关。本研究以ARPE－19细胞(广泛用于眼底疾病研究的一种细胞模型)为研究对象，也发现在缺氧刺激条件下，RPE细胞分泌IL－1β、IL－6的水平升高，与上述文献报道的结果相符。

图5 各组细胞LC3B－Ⅱ/Ⅰ、Beclin－1和p62蛋白相对表达量的统计柱状图 A:LC3B－Ⅱ/Ⅰ蛋白;B:Beclin－1蛋白;C:p62蛋白。bP＜0.01 vs缺氧组。

作为普遍存在于真核生物细胞内的一种机制，细胞自噬能对内环境稳定进行自我维持，且在生长、发育等多种生理活动中发挥重要作用，多种代谢应激可诱导自噬激活［1］。作为自噬标记蛋白，LC3、Beclin－1 和 p62 等被广泛用于自噬的研究中。LC3是自噬相关蛋白ATG8在哺乳动物的类似物，参与前体膜的延长和闭合，也参与自噬体的形成，故ATG8/LC3是自噬的重要分子标记物［14］。LC3在其C末端被ATG4剪切，形成LC3－Ⅰ。LC3－Ⅰ通过ATG7和ATG3与磷脂酰乙醇胺相结合形成酯化产物LC3－Ⅱ，特异性结合于自噬体膜上。LC3－Ⅱ始终稳定地保留在自噬体膜上直到与溶酶体融合。Beclin－1是自噬相关蛋白ATG6在哺乳动物的类似物，是其他自噬蛋白基因参与自噬形成过程的必须成分［15］，当自噬被抑制时，Beclin－1的表达降低。p62/SQSTM1蛋白是一种同LC3相互作用的蛋白，对降解底物的识别和包裹起着关键作用，p62的蛋白表达越低，说明底物降解越少，则自噬活性越强，即p62的水平与自噬活性呈负相关［16］。由于LC3抗体对LC3－Ⅱ具有更高的亲和力，会造成假阳性结果，因此判断自噬活性的强弱还需同时考虑溶酶体活性的影响。在研究中需要结合LC3－Ⅱ及p62的蛋白表达综合判断自噬活性的强弱。本研究发现在缺氧条件下，RPE细胞的LC3B－Ⅱ/Ⅰ(LC3B是LC3的主要亚型)、Beclin－1蛋白表达增加及p62蛋白表达下降，证实缺氧诱导了RPE细胞的自噬激活。

众所周知，视网膜对缺氧及继发的氧化应激高度敏感，故各种缺血性视网膜疾病，如糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞等都与缺氧密切相关。因此，本研究将缺氧作为刺激条件，观察RPE细胞功能与其自噬水平的关系。鉴于不同自噬抑制剂的作用机制存在差异，在本研究中我们采用了两种自噬抑制剂对RPE细胞进行了干预，以避免使用某一种抑制剂可能带来的结果偏差。其中，3－MA是一种应用广泛的自噬抑制剂，它作用于自噬诱导阶段，特异性阻断自噬体的形成［17］，故作用后 LC3－Ⅱ/Ⅰ及Beclin－1的表达降低，p62的表达升高(不能被降解);CQ是一种溶酶体自噬抑制剂，可以阻止晚期阶段自噬体与溶酶体的结合，抑制自噬的降解，使得自噬体在细胞内增加，作用后会使LC3－Ⅰ向LC3－Ⅱ的转换增加更为明显［18］，故作用后LC3－Ⅱ/Ⅰ及p62的表达升高，而Beclin－1的表达降低(自噬过程被抑制)。10mmol/L是用3－MA处理ARPE－19 细胞的常用浓度［19－20］，故本研究也采用了这一浓度。此外，有研究发现，10～30μg/mL CQ不会影响细胞活力和代谢，且10～20μg/mL的浓度对细胞活力的影响无明显差异［21］。另一研究提示，10μmol/L CQ 作用于ARPE－19细胞24h不会导致细胞死亡，而在250μmol/L时几乎100%的细胞死亡，预测LD50介于100～120μmol/L之间［22］。因此，本研究选择 50μmol/L(即 16μg/mL)浓度的CQ来抑制自噬也是合理的。本研究发现缺氧刺激可促进RPE细胞表达IL－1β、IL－6，3－MA或 CQ处理后减少了二者的表达。3－MA和CQ预处理得到的结果一致，证明抑制自噬能减少RPE细胞表达IL－1β和IL－6。

IL－1β是IL－1家族成员之一，是细胞间信号传递的基本的介质，具有多种生物功能活性，例如促进成纤维细胞增生、透明质酸酶和前胶原的合成等［5，23］。IL－6是一种单链糖蛋白，是与机体免疫、各种器官生理功能有关的多向性细胞因子，调节细胞生长、分化、凋亡、转化及免疫反应［24－25］。目前，越来越多的研究认为自噬与机体免疫和炎症有着密切的关系，但在眼科的相关研究较少［3，26］。因此，本研究观察了不同刺激条件下RPE细胞分泌IL－1β和IL－6的情况及其与细胞自噬的联系。结果表明，在缺氧刺激条件下 RPE细胞自噬激活，表现为LC3B－Ⅱ/Ⅰ、Beclin－1 表达增强，p62 表达减弱，同时细胞分泌IL－1β和IL－6的水平升高，且采用自噬抑制剂3－MA和 CQ能够减少 IL－1β和 IL－6的表达。鉴于IL－1β和 IL－6在纤维增生等病理过程中起重要作用［27－28］，我们推测缺氧诱导自噬激活并促进 RPE细胞分泌IL－1β和IL－6，可能是这些炎性因子参与多种眼底疾病病理过程的重要机制。不过，自噬对RPE细胞分泌IL－1β和IL－6的具体调控机制，以及对纤维增生性眼病的确切影响还需进一步研究。