高娅北，李成刚，陈二龙，张明刚，孔德辉，孙占伟，史龙飞，宋朝鹏

1 河南农业大学烟草学院，郑州文化路95号 450002；

2 河南中烟工业有限责任公司，河南 郑州 450016；

3 河南中烟工业公司安阳卷烟厂，河南 安阳 455000；

4 河南省烟草公司洛阳市公司，河南 洛阳 471000

类黄酮是植物体内的一种重要次生代谢物质，其本身所具有的抗氧化特性对植物的品质形成有重要意义[1-2]。在烟草中，类黄酮含量的高低直接影响烤后烟叶的等级、香气质量等烟叶品质因素[3]。成熟期是烟叶品质形成的关键时期，也是烟叶类黄酮合成积累的关键时期，因此，研究成熟期烤烟类黄酮合成机理具有重要意义。大量研究表明PAL、C4H、4CL、CHS和CHI是植物黄酮类物质代谢途径中的合成相关酶[4-6]，在许多作物的研究中证实这些酶活性和基因表达量的高低可直接影响类黄酮的积累量[7-9]。对于烤烟而言，较低的生长温度可增强烟叶PAL、C4H、4CL和CHI酶活性，从而增加烟叶类黄酮的积累量[10]；张刚[11]研究表明，施氮水平过高会影响烟叶PAL、C4H、4CL和CHI酶活性，减少烟叶类黄酮的积累量；贾宏昉等[12]研究表明不同生态区烤烟烟叶类黄酮积累量受PAL、C4H、4CL、CHS和CHI等基因表达量调控；Jia等[13]研究表明，无机磷的缺乏可导致烟叶类黄酮合成的相关基因CHS和CHI等转录水平的增加，促进烟叶类黄酮的积累。目前对于烟叶类黄酮合成的研究多集中于相关酶活性变化或是合成相关酶基因的表达量差异等单一方面，缺乏对烤烟成熟期类黄酮合成量、相关酶活性变化及基因表达模式的系统性研究，烤烟成熟期类黄酮合成机理尚不明确。本研究以烤烟品种豫烟6号、K326和ND202为材料，测定烟株打顶后不同时期中部叶类黄酮含量及上游合成相关酶PAL、C4H、4CL、CHS和CHI的活性变化，分析烟叶成熟过程中类黄酮合成路径上游相关酶基因的表达规律，旨在系统探究成熟期烟叶类黄酮的合成规律，为烤烟品种选育及优质烟叶生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

田间试验于2017年在河南省洛阳市洛宁县烟草科技示范基地（地处东经111°38＇，北纬34°26＇）进行。试验田植烟土壤为黄棕壤，肥力中等，0～20cm土层含有机质13.52 g/kg、碱解氮75.18mg/kg、速效磷9.17 mg/kg和速效钾164.37 mg/kg，土壤pH7.26。

选用豫烟6号、K326和ND202为试验品种，重复3次，共9个小区，采用随机区组设计，每小区种植烟株300株，行距110 cm，株距55 cm，按照当地优质烟叶生产技术规范种植管理，烟田施氮量为72kg/hm2，使用烟草专用复合肥，N∶P2O5∶K2O＝1∶1∶2。打顶后当d、10d、20d、30d、40d和50d取样（打顶后30d中部叶达到适熟状态），每小区采集生长情况正常、叶片完整且朝向一致的烤烟中部叶（10～12叶位）10片，采后在30分钟内去除主脉，混合第6至第7支脉间叶肉样品10g左右，用锡纸和纱布包裹后放入液氮中速冻，置-80℃超低温冰箱保存，用于烟叶类黄酮含量、类黄酮合成相关酶活性以及合成相关酶基因表达量的测定。

1.2 测定指标与方法

1.2.1 类黄酮含量测定方法

取-80℃保存的烟叶样品采用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，将干燥后的样品磨碎过40目筛。称取样品0.1g采用植物类黄酮试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司生产）进行烟叶类黄酮含量的测定。

1.2.2 类黄酮合成关键酶活性的测定

粗酶液提取：称取0.1g-80℃保存的烟叶样品，加入1mlPBS缓冲液冰浴匀浆，10000g 4℃离心10min，置于冰上待测。PAL、C4H、4CL和CHI酶活性采用微量法酶活性试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司生产）测定；CHS酶活性采用植物查尔酮合成酶ELISA试剂盒（上海通蔚实业有限公司生产）测定。

1.2.3 类黄酮合成关键酶基因表达量分析

采用Trizol法提取烟草样品中总RNA，反转录合成cDNA[14]。通过NCBI搜索植物类黄酮相关基因的cDNA序列，设计qRT-PCR引物（表1），利用QuantiFast SYBR Green PCR Kit试剂盒（Qiagen，Germany）在LightCycler 480Ⅱ型荧光定量PCR仪（Roche，Swiss）上进行qRT-PCR检测。选用烟草核糖体蛋白编码基因NtL25作为内参基因。实验结果采用2-ΔΔCt[15]算法进行分析，确定各基因的相对表达量。试验设置3次重复。植物类黄酮生物合成路径见图1。

1.3 数据分析

运用Microsoft Excel 2010进行试验结果统计整理，运用Origin 2018进行图片绘制，运用SPSS 22进行数据分析。

表1 烟草类黄酮合成相关酶基因qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequence for tobacco flavonoid synthetase gene

图1 植物类黄酮生物合成路径Fig.1 Plant flavonoid biosynthesis pathway

2 结果

2.1 烟叶类黄酮含量变化

三个烤烟品种的类黄酮含量测定结果（表2，3）表明，不同品种及不同时期间烤烟烟叶类黄酮含量均有极显著差异；三个烤烟品种烟叶在打顶后即烟株进入成熟期，类黄酮含量呈现出先增加后降低的变化趋势，在成熟时（打顶后30d）含量达到最大值，而后随成熟度进一步增加含量逐渐降低，表明成熟期是烟叶类黄酮积累的重要时期。品种间比较发现，类黄酮含量基本表现为豫烟6号＞K326＞ND202，其中ND202烟叶类黄酮含量除打顶后20d外均显著低于其他两品种，豫烟6号烟叶类黄酮含量在打顶后当天、30d和40d均显著高于其他两品种。

表2 烤烟烟叶类黄酮含量方差分析Table 2 Variance analysis of flavonoids content in flue-cured tobacco leaves

2.2 类黄酮合成相关酶活性的变化

类黄酮合成相关酶PAL、C4H、4CL、CHS和CHI活性测定结果（图2）表明，这些相关酶与类黄酮含量的变化趋势相同，类黄酮合成相关酶活性基本呈现出先升高后降低的变化规律。三个品种间类黄酮合成相关酶活性除个别时期外，基本表现为豫烟6号＞K326＞ND202，说明不同基因型烤烟品种间类黄酮合成水平差异较大。C4H、4CL、CHS和CHI酶活性基本都在烟叶成熟时（打顶后30d）达到最大值，而后活性迅速降低，说明成熟期是烟叶酶促反应发生的关键时期。

各品种烟叶PAL活性均在打顶后20d达到最大 值，分 别 为70.69、77.76和83.20U·mg-1·FW，随后活性迅速降低，于打顶后50d降至最低值（图2-A）。各品种烟叶C4H和4CL活性变化趋势较为一致，均在打顶后表现出先略有下降，而后上升的趋势（图2-B、图2-C），各品种烟叶C4H活性均在打顶后30d最高，随后迅速降低，于打顶后50d降至最小值，活性降低50%左右，豫烟6号和K326烟叶4CL活性在打顶后30d活性达到最大值，而K326在打顶后40d活性达到最大值，豫烟6号和K326烟叶4CL活性无明显差异。各品种烟叶CHS和CHI活性均表现出先缓慢增加，于打顶后30d达最大值，而后降低的变化趋势（图2-D、图2-E），各品种间活性差异较小。

2.3 类黄酮合成相关酶基因的qRT-PCR表达量

烟草类黄酮合成酶基因相对表达量测定结果（图3）表明，打顶后不同品种烟叶各时期类黄酮合成相关酶基因相对表达量基本表现为豫烟6号＞K326＞ND202，说明不同基因型间基因表达差异也较大。PAL基因表达量在打顶后逐渐上调，在打顶后30d表达量相对较高，而后迅速下调；C4H基因表达量在打顶后逐渐上调，在打顶后30d达到最大值，而后略有下调趋势，但各时期变化浮动较小；4CL1基因表达量在打顶后波动性较大，变化规律不明显，且各时期表达量变化差异较小；4CL2基因表达量在打顶后表现出缓慢上调趋势，于打顶后30d达到峰值，前后变化差异较大；CHS、CHI基因表达量均在打顶后30d达到最大值，其中CHI基因表达量在打顶后变化不明显，而CHS基因在打顶后表达量表现出迅速上调的趋势。因此，PAL、4CL1和CHS基因表达量与类黄酮积累变化趋势相同，在烟叶类黄酮的合成积累过程中贡献较大。

表3 不同品种烤烟成熟期烟叶类黄酮含量变化Table 3 Change of flavonoid content in leaves of different flue-cured tobacco species during maturity stage OD·g-1·FW

图2 不同烤烟品种成熟期烟叶类黄酮合成相关酶活性Fig.2 Flavonoid synthetase activities in mature leaves of different flue-cured tobacco species

2.4 类黄酮含量与酶活、基因表达量的相关性分析

图3 不同烤烟品种成熟期烟叶类黄酮合成相关酶基因表达量Fig.3 Gene expression of flavonoid synthetase in mature leaves y of different flue-cured tobacco varieties

由表4可见，除4CL1基因外，烟叶类黄酮含量与合成相关酶活性、基因表达量均呈正相关关系。PAL、CHS和CHI活性与类黄酮含量相关性较强，其中PAL和CHI活性与类黄酮含量呈显著正相关关系（p＜0.05，r=0.8,0.81），CHS活性与类黄酮含量呈极显著正相关关系（p＜0.01，r=0.88），说明PAL、CHS和CHI活性的提高可能对类黄酮含量的积累有促进作用，其中CHS的促进作用更强；类黄酮合成相关酶基因中除4CL1外，其他基因表达量与类黄酮含量相关性均较强，其中PAL、C4H、4CL2和CHI基因表达量与类黄酮含量呈显著正相关关系（p＜0.05，r=0.82,0.78,0.79,0.82），CHS基因表达量与类黄酮含量呈极显著正相关关系（p＜0.01，r=0.96），说明PAL、C4H、4CL2和CHS基因可能对类黄酮含量的积累有调控作用，其中CHS的调控作用更强。各类黄酮合成关键酶活性间呈正相关关系，其中PAL酶活性与其他合成相关酶活性间相关性较弱，而其他酶活性间相关性较强，分别达到了显著或是极显著相关关系，说明这些合成酶间具有明显的协同作用；类黄酮合成相关酶活性与基因表达量间，除4CL1基因外均呈正相关关系，其中4CL1、4CL2和CHI基因表达量与各合成相关酶活性间相关性较弱，其他基因表达量与类黄酮合成相关酶活性相关性较强，除个别酶外，二者相关性达到显著或是极显著正相关关系。

表4 类黄酮含量与酶活、基因表达量的相关性分析Table 4 Correlation analysis between flavonoid content and enzyme activity and gene expression

3 讨论

烤烟类黄酮是烟叶组织中的一种重要的抗氧化物质，可在一定程度上减轻或消除逆境胁迫所引起的活性氧伤害，提高烟株的抗逆性[16]，同时也是烟叶中的一种重要的潜香型物质可被氧化酶直接催化生成醇类及呋喃类等香味物质，影响烟叶香气质量[17]，其含量与烟叶品质密切相关。烤烟类黄酮含量受栽培措施、环境因子及遗传因素等的共同影响[18-20]。钟楚等[21]研究表明，在不同的UV-B辐射处理下，烤烟烟叶类黄酮含量随烟叶的成熟而逐渐增加；董卓娅[22]研究表明，在不同纬度下，打顶后烤烟烟叶类黄酮含量随成熟度增加而增长，工艺熟期达到最大；本研究结果表明不同品种烤烟打顶后成熟期烟叶类黄酮含量均表现出相似的变化规律，烟株从打顶后至打顶后50d的成熟过程中，烟叶类黄酮含量呈现出先升高后降低的变化规律，于成熟时（打顶后30d）达到最大值。不同品种间烟叶类黄酮含量在成熟期各阶段差异显著，这可能与其品种遗传特性有关。

植物类黄酮代谢与其相关酶活性密切相连，首先由苯丙氨酸代谢途径中的PAL、C4H和4CL三个酶进行连续催化，形成类黄酮化合物的底物香豆酰辅酶A，而后在CHS的催化下形成查尔酮类化合物，CHS将苯丙氨酸途径次生代谢产物导向类黄酮化合物的生物合成，是类黄酮化合物代谢途径中的首个关键酶，随后由CHI进行进一步催化进行类黄酮单体的生成[23]。彭东、王爱华等[24-25]研究表明烟叶PAL、C4H和4CL活性随烟叶成熟而增强，成熟后随烟叶衰老而降低，本研究表明，烤烟烟叶PAL活性在打顶后呈现先升高后降低的变化规律，于接近成熟时达到最大值，这与前人的研究结果相似；C4H和4CL活性在打顶后先降低，这可能是由于打顶所引起烟株体内生理生化反应出现变化所引起的；各品种烟叶类黄酮合成相关酶活性均在打顶后逐渐升高，于成熟时达到最大值，这说明成熟期是烤烟类黄酮代谢的关键时期；成熟后各品种烟叶类黄酮合成相关酶活性均呈快速降低的变化趋势，可能是由于随生育期的延长烟叶逐渐衰老，体内生理代谢活动减弱所引起的。

PAL、C4H、4CL、CHS和CHI是烤烟类黄酮合成的相关酶，大量研究表明其基因参与了烟叶的类黄酮合成调控。本研究表明，不同品种烤烟成熟期PAL基因表达量呈先升高后降低的变化趋势，这与连文力[26]所研究的烤烟生育期PAL、CHS和CHI基因表达量变化规律相似；C4H基因表达量也呈现先升高后降低的变化趋势，这与杨慧芹[27]的研究结果不同，可能是由于烟株在生长发育期间的生长温度不同所引起的；4CL1基因表达量在成熟期变化规律不明显，前后波动较大，与4CL2表达量变化趋势差别较大，这表明4CL2基因对类黄酮合成的调控作用较大，4CL1基因对类黄酮合成的调控作用不大；各品种烟叶基因表达量基本表现出成熟期迅速上调，过熟衰老后迅速下调的趋势，说明成熟期是烟叶类黄酮合成关键基因对类黄酮合成调控的关键时期；各品种之间基因表达量的差异可能与其品种生态适应性及遗传特性有关。

本研究中相关分析表明， PAL和CHI活性与烟叶类黄酮含量达显著正相关水平，而CHS活性达极显著正相关水平，表明PAL、CHS和CHI活性对烟叶类黄酮含量的积累影响较大；PAL、C4H、4CL2和CHI基因表达量与烟叶类黄酮含量达显著正相关水平，而CHS基因达极显著正相关水平，表明PAL、C4H、4CL2、CHS和CHI基因对烟叶类黄酮合成的调控作用较强；因此可根据PAL、CHS、CHI活性和PAL、C4H、4CL2、CHS和CHI基因表达高低来判断烟叶类黄酮的合成积累水平；在本研究中，4CL1基因对烟叶类黄酮的合成呈负相关且相关系数较小，与4CL2基因差异较大，这主要是由于二者在苯丙氨酸代谢途径中分别负责调控不同代谢产物的生物合成所引起的[28]。

4 结论

在烤烟中部叶成熟期，叶片类黄酮含量呈现先增加后降低的变化规律，打顶后0-30d是烟叶类黄酮合成积累的关键时期，在叶片成熟时期含量达到最大值；在同一生态环境及栽培管理条件下，成熟期各阶段均以豫烟6号中部叶类黄酮含量最高；测定类黄酮合成酶活性发现，PAL、CHS和CHI三个类黄酮合成酶活性对烟叶类黄酮合成的相关性较大，其中CHS合成酶最大（p＜0.01，r=0.88）；基因表达模式研究发现，PAL、C4H、4CL2、CHS和CHI基因对烟叶类黄酮含量的积累相关性较大，其中CHS基因最大（p＜0.01，r=0.96），是烟叶类黄酮合成过程中的关键调控基因。本研究从分子生物学角度探究了不同品种烤烟中部叶成熟期叶片类黄酮合成、关键合成酶活性及其基因表达的规律，为烤烟品质形成的分子作用机理提供了理论基础。