汪晓龙,曹顺顺,张 鹏,舒传继

(鄂东医疗集团黄石市中心医院,湖北理工学院附属医院口腔科,黄石 435000;*通讯作者,E-mail:380061085@qq.com)

舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)作为头颈部最常见的恶性肿瘤,具有恶性程度高、浸润性强、生长迅速等特点,可累及舌肌而影响患者语言、进食、吞咽等功能[1],流行病学研究显示[2],该肿瘤发病率呈升高趋势,且出现年轻化。虽然现有的临床治疗手段不断进步,但由于该肿瘤早期便可出现淋巴结转移,致使患者总体生存率改善有效[3],侵袭和转移已成为TSCC患者预后不佳的主要因素[4]。原钙黏蛋白10(protocadherin 10,PCDH10)作为原钙黏蛋白家族成员,在调控细胞间黏附及细胞内信号传导中发挥重要作用[5],近年来研究发现[6],其在多种恶性肿瘤组织中呈低表达,且与患者预后有关。本研究分析TSCC组织中PCDH10表达,探讨其与临床病理特征的相关性,以及对预后的影响,以期为TSCC机制研究及临床治疗提供参考资料。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 临床资料 选取2010-03～2013-03在我院行手术治疗且临床资料完整的TSCC患者65例,术前未接受放化疗,术后病理证实为TSCC,其中,男性41例,女性24例,年龄35-77岁,平均年龄(54.51±10.62)岁,分化程度:低分化15例,中分化21例,高分化29例;根据2009年国际抗癌联盟(UICC)关于TNM分期标准:Ⅰ-Ⅱ期28例,Ⅲ-Ⅳ期37例;发生淋巴结转移39例。术中留取肿瘤及距离肿瘤边缘>3 cm处癌旁组织,快速置于液氮中,-70 ℃保存。本研究通过医院伦理委员会批准,所有患者均行知情同意。

1.1.2 主要试剂和设备 总RNA提取试剂盒(Trizol法)购自美国Invitrogen公司,逆转录试剂盒和聚合酶链式反应(PCR)试剂盒购自日本TaKaRa公司,PCDH10和内参引物由上海索宝生物科技有限公司设计合成,LightCycler 2.0实时荧光定量PCR仪购自瑞士Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 利用实时荧光定量PCR技术检测TSCC和癌旁组织中PCDH10 mRNA表达 称取50 mg TSCC或癌旁组织,剪碎研磨,按总RNA提取试剂盒(Trizol法)说明提取总RNA,利用紫外分光光度计测定总RNA纯度,要求A260/A280在1.80-2.20范围内为合格标准。按照逆转录试剂盒说明进行逆转录,按照PCR试剂盒说明配制反应体系,利用实时荧光定量PCR仪对引物扩增,引物序列如下。PCDH10上游:5′-ACTGCTATCAGGTATGCCTG-3′,下游:5′-GTCTGTCAACTAGATAGCTG-3′;β-actin上游:5′-ACAGAGCCTCGCCTTTGC-3′,下游:5′-TCATCTTCTCGCGGTTGG-3′。PCR反应条件:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性15 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸45 s,行36次循环。每个样品设6个平行复孔。用2-ΔΔCt法计算TSCC和癌旁组织中PCDH10 mRNA相对表达量。

1.2.2 病例随访 所有患者术后均行随访,随访形式包括门诊和电话,以术后第1天作为随访起始时间,以死亡作为终点事件,随访截止日期2018年3月31日。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 TSCC和癌旁组织中PCDH10 mRNA表达

TSCC组织中PCDH10 mRNA相对表达量为0.42±0.10,癌旁组织则为1.02±0.07,差异有统计学意义(t=37.977,P<0.001)。

2.2 TSCC组织中PCDH10 mRNA表达与临床指标间关系

TSCC组织中PCDH10 mRNA表达与性别、年龄、吸烟和饮酒无关(P>0.05),而与分化程度、TNM分期和淋巴结转移有关(P<0.05,见表1)。

2.3 TSCC组织中PCDH10 mRNA表达对预后的影响

随访时间2-96个月,随访过程中,失访4例,失访率6.15%。以TSCC组织中PCDH10 mRNA相对表达量的P25=0.37值作为界值,将患者分为低表达(n=15)和高表达(n=46)。低表达组患者中位生存时间19个月,总生存率20.00%,高表达组患者中位生存时间45个月,总生存率45.65%,Log-Rank检验差异有统计学意义(χ2=11.096,P=0.001,见图1)。

2.4 影响TSCC患者生存时间的多因素回归分析

以性别、年龄、吸烟、饮酒、分化程度、TNM分期、淋巴结转移和PCDH10 mRNA表达作为自变量进行Cox比例风险回归分析,结果显示,发生淋巴结转移(HR=0.303,95% CI 0.128-0.716)和PCDH10 mRNA低表达(HR=0.406,95% CI 0.178-0.923)是影响患者生存时间的风险因素(见表2)。

指标nPCDH10 mRNA表达量tP性别0.42±0.100.9220.360 男性410.43±0.10 女性240.41±0.11年龄1.5800.119 >55岁440.41±0.10 ≤55岁210.45±0.11吸烟1.1490.255 是240.40±0.10 否410.43±0.10饮酒0.6540.515 是150.41±0.07 否500.43±0.11分化程度2.9700.004 中低分化360.39±0.10 高分化290.46±0.09TNM分期4.7480.000 Ⅰ-Ⅱ期280.48±0.08 Ⅲ-Ⅳ期370.38±0.09淋巴结转移3.2620.002 是390.39±0.11 否260.47±0.08

3 讨论

目前,临床上治疗TSCC主要以手术切除为主,辅以放化疗,但由于该肿瘤侵袭性强,早期便可出现颈淋巴结转移,多数患者临床确诊时已处于晚期,导致患者总体预后较差且易复发[7]。近年来,随着分子靶向治疗在肿瘤治疗中的应用,积极探讨影响TSCC发生、进展及预后的敏感基因,成为TSCC治疗的新方向。PCDH10基因位于人染色体4q28.3,是一种膜蛋白,近年来研究发现,其可能发挥抑癌基因的作用而参与肿瘤发生[8],在结直肠癌[9]、B细胞淋巴瘤[10]、子宫内膜癌[11]等多种恶性肿瘤组织中呈低表达,邱禅等[12]指出,过表达PCDH10可显著抑制胰腺癌BXPC-3细胞的增殖、侵袭及迁移,促进细胞凋亡。Ye等[13]亦指出,PCDH10可抑制原发性肝癌细胞增殖,诱导细胞加速凋亡。本研究结果显示,TSCC组织中PCDH10 mRNA相对表达量低于癌旁组织,说明PCDH10在TSCC组织中呈低表达,可能发挥抑癌基因的功能而参与TSCC发生过程。研究发现,PCDH10 mRNA在中低分化、TNM分期Ⅲ-Ⅳ期和发生淋巴结转移的TSCC组织中表达量降低,说明PCDH10低表达可能参与了TSCC恶性化进展过程。

图1 TSCC组织中PCDH10 mRNA表达对预后的影响Figure 1 Effect of the expression of PCDH10 mRNA on prognosis in TSCC tissues

表2影响TSCC患者生存时间的Cox比例风险回归分析

Table2CoxproportionalhazardregressionanalysisforinflencingfactorsonthesurvivaltimeofpatientswithTSCC

指标BSEWaldPHR(95% CI)性别0.2640.3550.5510.4581.302(0.649-2.611)年龄0.1220.4070.0900.7651.129(0.509-2.505)吸烟0.2760.3640.5760.4481.318(0.646-2.692)饮酒-0.1860.4490.1720.6780.830(0.344-2.001)分化程度-0.1150.3540.1060.7450.891(0.445-1.785)TNM分期0.0570.3910.0210.8841.059(0.492-2.279)淋巴结转移-1.1940.4397.3990.0070.303(0.128-0.716)PCDH10 mRNA表达-0.9020.4194.6290.0310.406(0.178-0.923)

有研究指出[14],PCDH10可作为预测胃癌患者预后的指标。本研究Kaplan-Meier生存分析结果显示,低表达组患者中位生存时间和总生存率均低于高表达组患者,说明PCDH10与TSCC患者预后有关,低表达组患者生存时间和总生存率降低。Cox比例回归分析结果显示,淋巴结转移和PCDH10 mRNA表达与患者生存时间相关,发生淋巴结转移及PCDH10 mRNA低表达是影响患者生存时间的危险因素,进一步说明PCDH10 mRNA表达量可能成为预测TSCC患者预后的指标。

综上所述,PCDH10在TSCC组织中呈低表达,可能作为抑癌基因而参与TSCC发生及进展,且与患者预后有关,PCDH10低表达是影响患者预后的风险因素,有望为TSCC发病机制及基因靶向治疗提供新的靶位。