郭 琪,胡 娇,宋永春,张 毅,胡明军*

(1西安市胸科医院外科,西安 710000;2西安交通大学第一附属医院肿瘤外科;*通讯作者,E-mail:769015264@qq.com)

肺癌是目前威胁人类健康最常见的恶性肿瘤,其发病率在所有恶性肿瘤居于首位[1]。目前对于肺癌的治疗,专家共识仍是以手术为主的综合性治疗,并且目前的治疗技术已经有了很大的进展,但是,仍有较多的患者(约75%-82.5%)在临床诊断时就已经处于中晚期,其5年生存率低于20%,这与肺癌早期诊断及早期治疗困难有关[2]。所以,发现一种经济、灵敏、准确度高的肺癌诊断方法,对于疾病的治疗、预后均具有十分重大的意义。

目前研究发现,基因甲基化改变与恶性肿瘤的发生具有密切的关系,且相关基因甲基化检测对于胃癌、乳腺癌及肺癌等恶性肿瘤的诊断及鉴别诊断具有一定的指导意义。既往研究发现[3,4],大麻素受体相互作用蛋白-1(cannabinoid receptor interacting protein 1,CNRIP1)基因在胃癌、结直肠癌、前列腺癌患者中呈现高甲基化状态,但是,尚无研究探讨CNRIP1基因甲基化改变与肺癌的关系。所以,本研究旨在通过研究肺癌组织及对应的患者痰液中该基因的甲基化发生率,并与正常组织及健康人群对照分析,研究该基因甲基化改变与肺癌的相关性,分析探讨甲基化改变与肺癌的病理分型、病期、性别等的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2016-01～2017-06就诊于西安市胸科医院和西安交通大学第一附属医院并行手术治疗的肺癌患者80例,所有患者术后病例均提示恶性肿瘤,并于手术前3 d指导患者留取晨起深部痰液,置于Saccomanno固定液中。所有肿瘤组织及癌旁组织(距癌组织边缘大于5 cm)均于离体后30 min内取材于液氮中冻存。选取西安交通大学第一附属医院体检中心就诊的健康人员的痰液标本30例作为对照,所选健康人员按年龄分层随机选取,并且无肺部疾病,所有痰液均为晨起深部痰液。所有研究对象均签署知情同意书,并报医院伦理委员会批准。为控制误差及偏倚,所有标本收集、保存的人员不参与具体实验。

1.2 主要试剂

组织及血浆DNA提取试剂、甲基化修饰试剂盒、PCR试剂等均购买自天根生化科技(北京)有限公司。PCR引物由华大基因(BGI)合成。

1.3 甲基化特异性PCR法检测痰液及组织DNA甲基化状态

甲基化特异性PCR方法(MSP法)的原理:DNA启动子区的胞嘧啶(C)在亚硫酸盐修饰后则变为尿嘧啶(U),而发生甲基化的胞嘧啶(C)则在亚硫酸盐修饰后不变;以亚硫酸盐修饰后的DNA作为PCR模板,分别以甲基化特异性引物和非甲基化特异性引物进行PCR扩增,根据结果判定目标基因的甲基化状态。具体分析如下:①该样本DNA只以甲基化特异性引物进行PCR后获得条带,判定为该样本中此基因发生了甲基化改变;②而样品DNA以甲基化特异性引物和非甲基化特异性引物分别进行PCR后均获得条带,也判定为该样本此基因发生了甲基化改变;③当该样本DNA仅以非甲基化特异性引物进行PCR后均获得条带的,判断该样本此基因未发生甲基化改变。

1.3.1 DNA提取 严格按照说明书采用天根生化科技有限公司的基因组提取试剂盒对组织标本和痰液标本进行基因组DNA提取。提取结果均采用紫外线分光光度计测定纯度和含量。

1.3.2 亚硫酸盐修饰 按照说明书采用EpiTect BisulfiteKit试剂盒对所提取的DNA进行基因甲基化修饰。

1.3.3 MSP法检测 CNRIP1基因启动子区甲基化程度具体引物及退火温度[5](见表1)。

表1CNRIP1基因MSP引物及退火温度

Table1PrimersofCNRIP1MSPandannealingtemperature

引物名称 引物序列(5′-3′)产物大小(bp)退火温度(℃)CNRIP1 MSP-M正向:TCGTTTTTTGGTATAGTGGTC174 52反向:CAAATCCGCGCAACTAAACNRIP1 MSP-U正向:GTTTTGTTTTTTGGTATAGTGGTT177 52反向:CAAATCCACACAACTAAAAAC

CNRIP1 MSP-M:CNRIP1基因甲基化特异性引物;CNRIP1 MSP-U:CNRIP1基因非甲基化特异性引物

PCR反应体系为25 μl,包括双蒸水11.75 μl,模板3 μl,引物(正/反)各1 μl,dNTPs 2 μl,DNA buffer 6 μl,DNA聚合酶(HotStar Taq enzyme)0.25 μl。反应条件:95 ℃预热30 s;94 ℃ 30 s,48 ℃ 30 s(退火),72 ℃ 30 s,共35个循环;72 ℃ 5 min。结果经2%琼脂糖凝胶电泳及紫外显像,结果根据上述原理中判读标准进行判读,记录发生甲基化的组织或痰液标本例数。

1.3.4 统计分析 运用SPSS 13.0软件对肺癌组织和癌旁组织标本之间CNRIP1基因甲基化发生率的差异、肺癌患者和健康对照痰液标本中CNRIP1基因甲基化发生率的差异以及根据性别、病理分型、病理分期、吸烟与否对肺癌患者进行分组,比较不同组别之间该基因甲基化发生率之间的差异,统计分析采用卡方检验进行检测,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织及痰液CNRIP1基因甲基化结果

根据甲基化结果判定标准判读,80例肺癌组织中,68例中CNRIP1基因发生了甲基化改变,发生率为85%,而80例癌旁组织,仅7例中该基因发生了甲基化改变,发生率为8.75%,差异具有统计学意义(P<0.01);80例肺癌患者的痰液标本中,63例痰液CNRIP1基因发生了甲基化改变,其发生率为78.75%,而30例健康对照组的痰液中仅1例中检测出甲基化改变,发生率仅为3.33%,差异具有统计学意义(P<0.01,见表2,图1)。

表2组织及痰液标本CNRIP1基因甲基化发生比较(例)

Table2ComparisonofCNRIP1genemethylationbetweentissuesamplesandsputumsamples(cases)

标本类型nCN RIP1基因甲基化状态阳性阴性χ2P组织标本93.4<0.01 癌组织806812 癌旁组织80773痰液标本51.0<0.01 肺癌患者806317 健康对照30129

M.以甲基化特异性引物进行PCR后条带;U.以非甲基化特异性引物进行PCR后条带图1 组织及痰液CNRIP1基因甲基化结果Figure 1 Methylation results of CNRIP1 gene in tissues and sputum

结果显示,肺癌患者的痰液与组织标本的甲基化发生率具有较高的一致性,其Kappa检验提示:Kappa值为0.791,大于0.75,具有较高的一致性(见表3)。所以,痰液基因甲基化可以反映癌组织的基因甲基化改变。

表3肺癌患者痰液与组织标本CNRIP1甲基化发生率一致性比较(例)

Table3ConsistencyofCNRIP1genemethylationintissuesandsputumoflungcancer(cases)

痰液标本组织标本阳性阴性Kappa阳性6300.791阴性512

2.2 痰液CNRIP1基因甲基化与肺癌患者临床病理特征之间的相关性分析

根据患者的性别、吸烟状况、病理分型、病理分期等进行分类,结果显示痰液CNRIP1基因甲基化状态与性别、吸烟状况、病理分期等无相关性,但是,在45例鳞癌患者痰液标本中,41例发生了甲基化改变,其甲基化发生率为91.1%,其发生率较其他类型肺癌患者均明显增高,差异具有统计学意义(P=0.009,见表4)。

表4痰液CNRIP1基因甲基化与肺癌患者临床病理特征之间的相关性(例)

Table4RelationshipsbetweenCNRIP1genemethylationinsputumoflungcancerandclinicopathologicfeatures(cases)

指标nCNRIP1基因甲基化状态阳性阴性χ2P性别0.060.80 男453510 女35287吸烟状况0.150.70 是39309 否41338病理分型9.46a0.009 鳞癌454147.81b0.005 腺癌251690.05c0.83 小细胞肺癌10646.37d0.012病理分期0.420.93 TNM Ⅰ级1293 TNM Ⅱ级35287 TNM Ⅲ级30246 TNM Ⅳ级321

a病理分型三组比较;b腺癌组和鳞癌组比较;c腺癌组和小细胞肺癌组比较;d鳞癌组和小细胞肺癌组比较

3 讨论

肺癌目前是威胁人类健康且发病率最高的恶性肿瘤,其发病率及死亡率均居于恶性肿瘤的首位。众所周知,对于恶性肿瘤最重要的是早期诊断和早期治疗,目前对于肺癌的诊断方法主要有CT、肿瘤标志物、穿刺活检等[6-8]。但是,目前在中国,疾病发现时大多处于中晚期(约占75%-82.5%)[2],这与本研究中所发现的比例大致相同(本研究中处于I期的患者仅占15%,中晚期患者占85%)。所以,研究发现疾病的早期诊断方法对于疾病的治疗就显得至关重要。

目前研究认为,基因甲基化参与基因转录翻译启动的调节,从而参与到肿瘤的发生发展中来,既往研究发现,P16、APC、MGMT、ASC和DAPK等抑癌基因在胃癌、食管癌、肺癌等疾病中均发生甲基化改变,从而导致基因表达沉默[9,10]。

既往研究发现,外周血、粪便等组织基因甲基化对于肿瘤的早期诊断具有一定的意义,且标本易于采集、对患者无创且容易接受。Guo等[11]通过粪便检测FBN1基因甲基化用于结直肠癌的检测;黄大业等[12]通过血浆检测MAL基因甲基化对于肺癌的检测,但对于病理分型无意义;王长春等[13]通过外周血对于APC、RARβ2、CDH1、p16INK4α、RASSF1A抑癌基因的甲基化状态进行检测,并且分析基因甲基化状态与食管癌的相关性。但对痰液基因分析的报道尚不多见,封杰等[14]对痰液、气管灌洗液等标本中MPDZ基因甲基化进行分析,结果显示:痰液标本中甲基化检出率为55%,比本研究的检出率略低,但也提示了痰液甲基化监测对于肺癌的意义。

既往研究[3,4]发现大麻素受体相互作用蛋白-1(cannabinoid receptor interacting protein 1,CNRIP1)基因甲基化对于结直肠癌具有明显的相关性,说明该基因是一种潜在的抑癌基因。既往诊断肺癌的基因甲基化研究均提示对于病理分型无相关性,对于疾病的早期诊断有意义,但对于病理分型无意义,例如,封杰等[14]通过痰液检测MPDZ基因甲基化对于肺癌的检测,提示肺癌患者痰液MPDZ基因甲基化发生率为55%,对于疾病的诊断准确度和灵敏度分别为55%和100%[14]。本研究发现,痰液CNRIP1基因甲基化检测对于肺癌的诊断准确度和灵敏度分别为78.75%和96.67%,这与既往研究的准确度和灵敏度大致相同。并且,本研究提示CNRIP1基因在肺鳞癌患者中甲基化发生率为91.1%,与其他类型的肺癌相比具有统计学意义,这提示CNRIP1基因甲基化对于鉴别肺癌的病理类型具有一定意义。

综上所述,痰液CNRIP1基因甲基化检测对于肺癌的早期诊断具有较高的敏感度和特异度,并且对于肺鳞癌的诊断具有更高的敏感度,对于肺癌的病理分型具有一定的理论指导意义。本研究从基本层面发现了CNRIP1基因甲基化改变与肺癌的相关性,这对于研究肺癌的发生发展以及基因靶点等提供了一定的线索,为后续研究作用机制等提供了一定的理论支持。