张 星,曹世福,段建峰,郝银萍,史蓓蓓

(山西医科大学晋祠学院基础医学部,太原 030205;*通讯作者,E-mail:zx2001-1983@sina.com)

记忆力减退和认知障碍是包括阿尔茨海默病、抑郁症、颅脑损伤等在内的中枢神经系统疾病的一种典型症状。研究发现,氧化应激是诱发记忆力减退和认知障碍的重要机制之一。李琨等[1]研究证实,参麻益智方可减少血管性痴呆大鼠海马组织的氧化应激,减少海马神经细胞损伤,改善大鼠的学习记忆能力。袁晓勇等[2]研究发现,刺五加注射液可增强大鼠抗氧化酶活性,提高抑郁大鼠的学习记忆能力。中草药中的黄酮成分具有清除自由基、抗氧化、抗炎症、抗病毒等多种生物活性和药理作用[3,4]。其中,银杏黄酮主要存在于银杏叶、种皮及种仁中,含量丰富,是天然的抗氧化剂,能够有效清除自由基、活性氧及一氧化氮等,并调节抗氧化酶的活性,减缓氧化损伤。本实验采取腹腔注射氢溴酸东莨菪碱,建立小鼠记忆障碍模型[5],探讨银杏黄酮对学习、记忆功能障碍大鼠的改善作用,为银杏黄酮抗氧化、抗衰老和提高记忆功能研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8周龄健康雄性清洁级SD大鼠40只,体质量(240±20)g,购自北京维通利华试验动物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2012-0001。大鼠饲养在PC聚碳酸酯鼠笼内,饲养条件为:温度20-25 ℃,湿度40%-70%;每小时换气10-20次;光照 ∶黑暗12 h ∶12 h。正式实验前进行适应性饲养1周。

1.2 药品、试剂

银杏黄酮购自徐州恒凯银杏制品有限公司(批号:N150111),东莨菪碱购自徐州莱恩药业有限公司(批号:H32022136)。

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)测定试剂盒,谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH-Px)测试盒,总抗氧化能力(total antioxide capacity,T-AOC)测定试剂盒,丙二醛(malondialdehyde,MDA)测定试剂盒,考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒,均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要仪器

Morris水迷宫计算机图像实时检测分析处理系统购自中国医学科学院药物研究所,包含可移动圆形恒温水池(直径180 cm,高40 cm)、配套圆柱形防滑平台(直径9 cm,高25 cm)、温控系统、水循环系统、视频摄像系统,系统软件可自动记录大鼠运动轨迹并实现图像的实时检测分析与处理。680型全自动酶标仪(美国伯乐)。

1.4 分组与模型制备

大鼠正常饲养1周随机分为4组,每组10只。对照组,灌胃生理盐水0.2 ml,1次/d,连续5周。模型组:灌胃生理盐水0.2 ml,1次/d,第36天开始造模,腹腔注射2 mg/kg氢溴酸东莨菪碱生理盐水溶液0.2 ml,制备大鼠获得性记忆障碍模型[6]。银杏黄酮高剂量组:以银杏黄酮溶于生理盐水,以20 mg/kg灌胃。银杏黄酮低剂量组:以2 mg/kg灌胃;1次/d,连续5周;第36天,灌胃银杏黄酮,干预1 h立即对银杏黄酮组分别腹腔注射2 mg/kg氢溴酸东莨菪碱;干预15 min立即进行空间学习记忆试验,连续7 d。

1.5 空间学习记忆试验

造模后第8天,开始Morris水迷宫试验。Morris水迷宫选用圆桶,水池直径100 cm,高40 cm,水深25 cm,水温控制在22-24 ℃,水中加入黑色墨水,使其不透明。把水池均分为一、二、三、四个象限,并作不同的标记。选第三象限正中放置高度为23 cm、直径8 cm的平台,位于水面以下2 cm,试验期间保持环境安静、恒温、自然光照、参照物恒定。试验前动物适应性游泳5 min。试验持续6 d,前5 d每天训练4次,每次持续5 min,第6天正式试验。

定位航行试验:随机从东、南、西、北四个象限边缘选1个入水点将大鼠面向池壁放入水中。如果大鼠在2 min内找到平台,记录2 min内寻找平台的时间(逃避潜伏期);如果大鼠在2 min内未找到平台,由试验者将大鼠轻轻引至平台,逃避潜伏期记为2 min,并使大鼠在平台停留10 s。

空间探索试验:定位航行试验全部结束后,次日撤去平台,进行空间探索试验。然后选第一象限相同的入水点将大鼠面向池壁放入水中,记录其2 min内跨越原平台位置的次数和大鼠在平台各象限停留的时间。

1.6 海马组织抗氧化指标测定

于试验结束后,麻醉处死大鼠,分离海马组织,在冰冷生理盐水中清洗干净后在1.5 ml Eppendorf离心管内,用眼科剪剪碎,加入9倍冰冷生理盐水后,倒入匀浆器内快速匀浆组织。然后倒入离心管,于3 000 r/min离心10 min,取上清检测SOD、GSH-Px、T-AOC和MDA的含量,操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠逃避潜伏期的比较

Morris水迷宫实验结果显示,随着训练天数的增加,各组大鼠逃避潜伏期逐渐缩短。与对照组相比,模型组大鼠的逃避潜伏期显著延长(P<0.05);与模型组相比,银杏黄酮低剂量组大鼠逃避潜伏期差异无统计学意义(P>0.05);银杏黄酮高剂量组大鼠逃避潜伏期显著缩短,差异有统计学意义(P<0.05)。与银杏黄酮低剂量组相比,银杏黄酮高剂量组大鼠逃避潜伏期显著缩短,差异有统计学意义(P<0.05,见表1)。

表1各组大鼠逃避潜伏期的比较(s)

Table1Comparisonoftheescapelatencyperiodofratsamongfourgroups(s)

组别第1天第2天第3天第4天第5天对照组26.23±4.3723.65±4.6321.72±3.9419.15±4.2416.39±4.45模型组42.34±5.26∗41.83±5.19∗39.25±5.19∗33.85±4.79∗28.43±4.67∗银杏黄酮低剂量组32.54±5.1331.23±4.7530.75±4.5925.26±4.3120.33±4.35银杏黄酮高剂量组30.26±4.49#27.82±5.06#25.41±4.73#21.41±4.34#18.86±3.72#

与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

2.2 各组大鼠在目标象限穿梭次数与在各象限的停留时间比较

与对照组相比,模型组小大鼠在原放置平台的象限(第三象限)内停留时间显著缩短,差异有统计学意义(P<0.05)。在该象限的穿越次数显著减少,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,银杏黄酮低剂量组在原放置平台的象限(第三象限)内停留时间和在该象限的穿越次数差异无统计学意义(P>0.05);银杏黄酮高剂量组在原放置平台的象限(第三象限)内停留时间显著延长,差异有统计学意义(P<0.05)。在该象限的穿越次数显著增多,差异有统计学意义(P<0.05)。与银杏黄酮低剂量组相比,银杏黄酮高剂量组在原放置平台的象限(第三象限)内停留时间显著延长,差异有统计学意义(P<0.05,见表2)。

表2各组大鼠在各象限停留时间与在目标象限穿梭次数的比较

Table2Comparisonoftheescapelatencyperiodandtimescroossingplatformofratsamongfourgroups

组别停留时间(s)第一象限第二象限第三象限第四象限目标象限穿梭次数对照组28.92±7.6230.87±6.5330.14±7.4830.07±4.7211.59±2.45模型组36.47±5.5427.54±4.2520.84±4.86∗35.15±6.058.83±3.94∗银杏黄酮低剂量组32.41±7.8229.85±5.4824.59±7.7633.15±6.288.71±3.52银杏黄酮高剂量组31.08±6.2731.45±5.4627.34±6.34#30.13±7.2210.26±3.78#

与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

2.3 大鼠海马组织中SOD、T-AOC、GSH-Px活性和MDA含量的测定结果

与对照组相比,模型组海马组织SOD、GSH-Px、T-AOC活性显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);MDA含量显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,银杏黄酮低剂量组海马组织SOD、GSH-Px、T-AOC活性和MDA含量差异无统计学意义(P>0.05);银杏黄酮高剂量组海马组织SOD、GSH-Px、T-AOC活性显著升高,MDA含量显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与银杏黄酮低剂量组相比,银杏黄酮高剂量组海马组织SOD、GSH-Px、T-AOC活性显著升高,MDA含量显著降低,差异有统计学意义(P<0.05,见表3)。

表3各组大鼠海马组织中SOD、T-AOC、GSH-Px活性和MDA含量

Table3ComparisonofSOD,T-AOC,GSH-PxactivitiesandMDAcontentinhippocampaltissuesofratsamongfourgroups

组别SOD(U/mg)GSH-Px(U/mg)T-AOC(U/mg)MDA(nmol/mg)对照组178.65±19.3237.60±4.1810.55±1.292.26±0.45模型组120.38±21.43∗22.31±5.63∗6.27±1.43∗3.95±0.63∗银杏黄酮低剂量组125.24±15.1624.55±3.797.44±1.543.27±0.56银杏黄酮高剂量组164.74±22.14#32.16±5.82#8.78±1.85#2.58±0.42#

与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

3 讨论

脑海马区神经细胞是动物主要的负责记忆和学习的细胞。海马区贫血、缺氧、组织损伤及神经元坏死等病因均可造成记忆功能衰退[7,8]。研究证实脑组织氧化应激在记忆功能衰退中发挥着重要的作用[9,10]。银杏黄酮具有抗氧化、抗炎、抗自由基等作用[11,12]。经典的Morris水迷宫试验广泛用于啮齿类动物空间学习和记忆功能研究[13,14]。本试验结果显示,东莨菪碱造成潜伏期显著增加,穿越目标象限平台位置的次数减少,学习记忆能力下降;银杏黄酮能显著缩短大鼠寻找平台的潜伏期,并显著增加其穿越目标象限平台位置的次数,表明银杏黄酮能有效改善东莨菪碱诱导的记忆障碍大鼠模型的学习记忆能力下降。SOD和GSH-Px是机体内广泛存在的重要的抗氧化酶,清除超氧自由基、过氧化氢、Ⅳ亲杂苫等活性氧簇(ROS),在生物体发挥抗氧化作用;过量的ROS会引发脂质过氧化物MDA蓄积[15],并引起海马神经元细胞膜损伤,导致学习记忆功能衰老及阿尔茨海默病、帕金森病等相关神经损伤疾病的发生[16]。

本研究结果显示,东莨菪碱造成海马组织抗氧化酶SOD、GSH-Px活性显著下降,机体总抗氧化能力指标T-AOC显著下降,并因此造成清除MDA能力降低和MDA含量升高。银杏黄酮显著升高海马组织抗氧化酶SOD、GSH-Px活性,并提高机体总抗氧化能力指标T-AOC,表明银杏黄酮显著增强大鼠脑组织清除自由基的能力;并显著降低MDA含量,减少过氧化产物对脑组织的损伤,抑制海马组织的氧化应激,从而改善大鼠的学习记忆功能。有研究发现,银杏黄酮能够增加脑血管流量,改善脑血管循环功能,清除自由基、超氧阴离子及一氧化氮等自由基,调节氧化应激损伤,提高机体免疫能力[17]。邓敏贞等[18]研究证实石菖蒲挥发油联合人参总皂苷减少阿尔茨海默病模型小鼠海马组织氧自由基的生成,提高脑组织SOD活性含量,降低活性和MDA含量,维持脑组织正常结构,抑制神经细胞凋亡,显著改善小鼠学习记忆能力,对AD具有较好的防治作用。因此,银杏黄酮能够升高抗氧化酶活性,调节氧化与抗氧化系统平衡,增强清除氧自由基的能力,抑制氧化应激,改善学习记忆功能。