王 英,刘 敏,于波涛,王敬东

(青岛市中心(肿瘤)医院,青岛大学医学院附属第二医院重症医学科,青岛 266003;*通讯作者,E-mail:617324523@qq.com)

心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)是临床上常见的心血管疾病,主要表现为心肌代谢紊乱、心功能低下以及细胞超微结构破坏等,严重威胁着人们的健康[1]。MIRI是指冠状动脉阻塞一定时间后,心肌缺血再灌注后所出现的心脏结构和功能障碍,严重时导致慢性心力衰竭和死亡[2-4]。目前,治疗急性心肌梗死的方式主要为溶栓治疗,但治疗后常出现MIRI,因此,如何缓解MIRI是研究的首要任务[5]。研究证实,室性心动过速、线粒体功能障碍、氧化应激以及心肌细胞凋亡均是导致MIRI的主要因素[4]。乙醛脱氢酶(ALDH)有两种亚型:线粒体型和胞质型,其中线粒体ALDH即为ALDH2,是一种广泛分布于人体组织器官中的四联体蛋白[6]。ALDH2是线粒体中重要的醛类氧化酶,而乙醇是ALDH2的非特异性激动剂[7,8]。近年来,关于ALDH2对心肌缺血再灌注损伤的保护作用引起了广泛关注。ALDH2是一种具有保护心脏功能的酶,能清除心肌代谢中产生的毒性醛类[9]。本实验通过建立心肌缺血再灌注损伤大鼠模型,采用ALDH2激动剂乙醇观察ALDH2高表达后,对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌线粒体功能和室性心动过速的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

实验动物:健康雄性SD大鼠60只,体质量为400-600 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。生长温度为(23±2)℃,环境湿度为45-50%,光照时间为每天12 h,自由进食、进水,适应性饲养1周。

主要试剂:心肌线粒体提取试剂盒、SOD和MDA的ELISA检测试剂盒均购自碧云天生物技术研究所;罗丹明123购自Sigma公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒及ECL发光试剂盒购自碧云天生物技术研究所;ALDH2抗体、Caspase-3抗体和β-actin抗体均购自Abcom公司;其余为国产分析纯试剂。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组及给药 选取60只健康雄性SD大鼠,随机分为3组:假手术(sham)组、MIRI model组和ALDH2组,每组20只。ALDH2组在建模之前,大鼠给予2.5%乙醇(乙醛脱氢酶2激动剂)日常饮用,1周后乙醇调整至5%,持续8周。然后建立大鼠心肌缺血再灌注(MI/R)模型。

1.2.2 心律失常监测 采用标准肢体Ⅱ导联心电图连续监测大鼠室性心动过速的发生率及其持续时间。室性心动过速的诊断标准:3个或3个以上连续出现畸形、增宽的QRS波群,QRS间期>0.12 s,其前无固定P波,心室率120-200次/min,节律略不规则,心房率少于心室率,可见房室分离、心室夺获或心室融合波。

1.2.3 ELISA法测定大鼠心肌组织中SOD和MDA的含量 实验结束后,各组大鼠立即进行断头处死。在无菌条件下取各组大鼠的心肌组织,并使用无菌Hank’s缓冲液洗涤2次。准确称取200 mg心肌组织,剪碎后放入匀浆管中,并加入2 ml生理盐水进行冰浴匀浆。3 500 r/min离心15 min后,收集上清液待测。使用ELISA检测试剂盒测定大鼠心肌组织中SOD和MDA的含量。具体操作步骤严格按照试剂和说明书进行。

1.2.4 流式细胞仪测定各组大鼠心肌细胞的线粒体膜电位 制备大鼠心肌细胞单细胞悬液。取1×105个细胞,1 000 r/min离心5 min,PBS洗涤沉淀2次。加入0.5 ml的罗丹明123染色液,充分混匀。将细胞置于37 ℃培养箱中孵育15 min。孵育结束后,4 ℃下600×g离心5 min,PBS洗涤沉淀2次。使用500 μl的PBS缓冲液重悬细胞,使用流式细胞仪测定各组大鼠心肌细胞的线粒体膜电位的变化情况。

1.2.5 q-PCR法检测大鼠心肌组织中Bax的mRNA表达 实验结束后,对各组大鼠进行断头处死,并分离出各组大鼠的心肌组织。采用组织匀浆机对心肌组织进行充分研磨。采用Trizol提取法提取血管中的总RNA,按照Micro RNA反转录试剂盒说明书对总RNA进行反转录。反转录体系为20 μl ∶1 μl总RNA,4 μl 5×Reaction Mix,2 μl 10×Super Script Enzyme Mix,加入双蒸水将体系补足至20 μl,混匀后离心。反应条件为:37 ℃ 60 min,95 ℃ 5 min,置于4 ℃保存备用。使用SYBR Green染料法进行测定,每个样本设置4个复孔。按照q-PCR试剂盒说明书进行转录扩增,反应体系为20 μl。基因的相对表达用2-ΔΔCt法进行计算。

1.2.6 Western blot检测大鼠心肌组织中ALDH2的蛋白表达 实验结束后,各组大鼠立即进行断头处死。在无菌条件下取各组大鼠的心肌组织,并使用无菌Hank’s缓冲液洗涤2次。提取心肌组织蛋白,采用Western blot检测心肌组织中ALDH2和Caspase-3的蛋白表达水平。使用BCA蛋白浓度试剂盒对蛋白进行定量。选取5%的浓缩胶和10%的分离胶,取20 μl蛋白样品进行上样,电泳结束后,将蛋白转移至PVDF膜上。使用10%的脱脂乳粉溶液进行封闭2 h后,一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育过夜。使用TBST洗膜三次,每次15 min,二抗(1 ∶4 000)室温孵育2 h,用TBST洗膜三次。使用化学发光法对蛋白进行显色。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠室性心动过速的测定

心律失常测定显示,与sham组相比,model组大鼠室性心动过速的发生率升高(P<0.01),其持续时间较长(P<0.01);而ALDH2组大鼠室性心动过速的发生率较model组降低(P<0.01),其持续时间较短(P<0.01,见表1)。说明ALDH2激动剂乙醇可抵抗大鼠心肌缺血再灌注损伤引起的室性心动过速。

组别n室性心动过速 发生率(%) 室性心动过速 持续时间(s) sham组2000.00±00.00 00.00±00.00model组2086.63±7.74∗∗144.68±11.72∗∗ALDH2组2038.94±5.16## 36.95±4.18## F55.656 71.230 P0.0000.000

与sham组相比,**P<0.01;与model组相比,##P<0.01

2.2 ELISA法测定大鼠心肌组织中SOD和MDA的含量

ELISA测定显示,与sham组相比,model组大鼠心肌组织中SOD的含量降低(P<0.01),MDA的含量升高(P<0.01);而ALDH2组大鼠心肌组织中SOD的较model组升高(P<0.01),MDA的含量降低(P<0.01,见表1)。说明ALDH2激动剂乙醇可缓解大鼠心肌缺血再灌注损伤引起的氧化应激反应。

组别nSOD(U/mg)MDA(nmol/mg)sham组2021.42±0.924.02±0.46model组2010.66±0.73∗∗8.63±0.62∗∗ALDH2组2014.95±0.62##5.45±0.53## F22.06513.724 P0.0030.012

与sham组相比,**P<0.01;与model组相比,##P<0.01

2.3 流式细胞仪测定各组大鼠心肌细胞的线粒体膜电位

采用阳离子绿色荧光染料罗丹明123对线粒体的膜电位进行检测,结果见表3。与sham组相比,model组大鼠心肌线粒体膜电位降低(P<0.01),而ALDH2组大鼠心肌线粒体膜电位较model组升高(P<0.01,见表3)。说明心肌细胞凋亡时会导致线粒体膜电位降低以及功能变化,而ALDH2激动剂乙醇可缓解线粒体的损伤情况。

组别n线粒体膜电位未降低细胞所占百分比(%)sham组2093.43±5.73model组2045.75±4.64∗∗ALDH2组2068.45±4.57## F25.237 P0.001

与sham组相比,**P<0.01;与model组相比,##P<0.01

2.4 q-PCR法检测大鼠心肌组织中Bax的mRNA表达

q-PCR测定结果见图1与表4。与sham组相比,model组大鼠心肌组织中Bax mRNA表达上调(P<0.01);而ALDH2组大鼠心肌组织中Bax的mRNA表达低于model组(P<0.01)。说明ALDH2激动剂乙醇可有效抑制心肌缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡。

图1 q-PCR法检测大鼠心肌组织中Bax的mRNA表达Figure 1 Bax mRNA expression in rat myocardium by q-PCR

组别nBax mRNA相对表达sham组201.00 model组201.53±0.14∗∗ALDH2组201.15±0.11## F11.392 P0.008

与sham组相比,**P<0.01;与model组相比,##P<0.01

2.5 Western blot检测大鼠心肌组织中ALDH2的蛋白表达

如图2和表5所示,与sham组相比,model组大鼠心肌组织中ALDH2的蛋白表达下调(P<0.01);而ALDH2组大鼠心肌组织中ALDH2的蛋白表达高于model组(P<0.01)。说明ALDH2激动剂乙醇可使MIRI大鼠心肌组织中ALDH2的蛋白表达增加。

1.ALDH2组；2.model组；3.sham组图2 Western blot检测大鼠心肌组织中ALDH2的蛋白表达Figure 2 Protein expression of ALDH2 in rat myocardium by Western blot

组别nALDH2/β-actin ALDH2组201.11±0.12## model组200.93±0.11 sham组200.29±0.08∗∗ F15.426 P0.002

与sham组相比,**P<0.01;与model组相比,##P<0.01

2.6 Western blot检测大鼠心肌组织中Caspase-3的蛋白表达

如图3和表6所示,Western blot测定显示,与sham组相比,model组大鼠心肌组织中Caspase-3蛋白表达上调(P<0.01);而ALDH2组大鼠心肌组织中Caspase-3蛋白表达低于model组(P<0.01)。说明ALDH2激动剂乙醇可降低MIRI大鼠心肌组织中相关凋亡蛋白Caspase-3的蛋白表达。

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤(MIRI)是临床常见的心血管疾病,常表现为室性心动过速,心功能不全及血压骤降等[10]。因此,如何避免和缓解MIRI的发生成为了当前研究的热点。线粒体乙醛脱氢酶2(ALDH2)作为机体内重要的醛类氧化酶,可减轻细胞的氧化损伤,保护心肌细胞,抑制心肌细胞凋亡[11-13]。在本研究中,通过建立心肌缺血再灌注损伤大鼠模型,采用ALDH2激动剂乙醇观察ALDH2高表达后,对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌线粒体功能和室性心动过速的作用机制。心电图可作为评价心肌缺血再灌注损伤的重要指标。本研究结果发现,心肌缺血再灌注损伤发生后,大鼠室性心动过速的发生率升高且持续时间较长,而长期给予ALDH2激动剂乙醇干预后,可降低大鼠室性心动过速的发生率及持续时间,提示ALDH2激动剂乙醇可抵抗大鼠心肌缺血再灌注损伤引起的室性心动过速。

1.model组；2.ALDH2组；3.sham组图3 Western blot检测大鼠心肌组织中Caspase-3的蛋白表达Figure 3 Protein expression of Caspase-3 in rat myocardium by Western blot

组别nCaspase-3/β-actin sham组200.13±0.04 model组200.95±0.14∗∗ ALDH2组200.45±0.09## F17.722 P0.004

与sham组相比,**P<0.01;与model组相比,##P<0.01

氧化应激是心肌缺血再灌注后导致心肌损伤的主要原因,MDA作为氧化应激的标志物,其含量可间接反应氧自由基对心肌脂质过氧化反应的程度[14]。SOD是一种可清除机体内氧自由基的特异性酶,其活性可反映机体的抗氧化能力[15,16]。本研究发现,心肌缺血再灌注损伤发生后,大鼠心肌组织中SOD的含量降低,MDA的含量升高,说明心肌缺血再灌注损伤导致了机体氧化应激反应的发生。同时,长期给予ALDH2激动剂乙醇干预后,大鼠心肌组织中SOD的含量升高,MDA的含量降低,说明ALDH2激动剂乙醇可缓解大鼠心肌缺血再灌注损伤引起的氧化应激反应。在心肌缺血再灌注损伤中,线粒体膜电位的变化也与心肌缺血再灌注损伤有着密切的关系[17]。在本研究中发现,心肌缺血再灌注损伤后,大鼠心肌线粒体膜电位降低,说明心肌细胞凋亡时会导致线粒体膜电位降低以及功能变化;而长期给予ALDH2激动剂乙醇干预后,大鼠心肌线粒体膜电位升高,说明ALDH2激动剂乙醇可缓解线粒体的损伤情况。

心肌细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤的表现之一,在细胞凋亡信号途径中,Bax是促凋亡蛋白,当Bax降低后,可导致前凋亡因子(细胞色素c)释放到胞质,从而激活Caspase 3,启动凋亡程序[18]。本研究发现,心肌缺血再灌注损伤后,大鼠心肌组织中Bax mRNA升高,而长期给予ALDH2激动剂乙醇干预后,大鼠心肌组织中Bax mRNA降低,说明ALDH2激动剂乙醇可有效抑制心肌缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡。本研究发现,心肌缺血再灌注损伤后,大鼠心肌组织中Caspase-3蛋白表达上调,而长期给予ALDH2激动剂乙醇干预后,大鼠心肌组织中Caspase-3蛋白表达下调,说明ALDH2激动剂乙醇可使MIRI大鼠心肌组织中ALDH2的蛋白表达增加,并且降低相关凋亡蛋白Caspase-3的蛋白表达。

综上所述,ALDH2激动剂乙醇可增强ALDH2在MIRI大鼠心肌组织中的表达,并对MIRI有保护作用,其机制可能与抵抗室性心动过速、缓解氧化应激反应、提高心肌组织中线粒体膜电位及抑制细胞凋亡的发生有关。