何雪娟，唐 雯，杨艳梅，庞雅贤，许 蕊，刘明清

(沧州医学高等专科学校，河北沧州 061001)

近年来，甲状腺疾病发病率明显上升[1-2]，如何预防及治疗甲状腺疾病成为当前医学研究的热点。目前已知甲状腺疾病的发生除了与年龄、性别、碘摄入量等有关外，还与遗传因素、自身免疫、感染等因素相关，尤其是考虑到某些基因的多态性可能影响到机体对疾病易感性而受到研究者的重视。Toll样受体4(TLR4)是近年来发现的重要的原体识别受体，在介导免疫反应及免疫相关的炎性反应中起着重要的作用[3]。本研究旨在探讨TLR4基因rs1927914位点多态性与Graves病(GD)、桥本甲状腺炎(HT)和单纯性甲状腺肿(SG)发病风险的相关性，为甲状腺疾病高危人群的筛检及诊治提供有利的分子生物学依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究选取2016年河北省沧州市居民甲状腺疾病流行病学调查项目确诊的部分病例为病例组研究对象，共纳入GD患者94例(GD组)，其中男24例、女70例；HT患者54例(HT组)，其中男13例、女41例；SG患者56例(SG组)，其中男12例、女44例；选取当地与病例组性别组成、年龄在±5岁范围内的健康人为对照组。纳入标准：(1)GD组，根据临床症状和甲状腺功能亢进的生化证实，包括弥漫性甲状腺肿、高放射碘摄取和高甲状腺素水平。(2)HT组，弥漫性对称性甲状腺肿大且质韧，生化检验甲状腺功能减退，并有甲状腺过氧化物酶自身抗体(TPOAb)，带或不带甲状腺球蛋白抗体(TgAb)。(3)SG组，甲状腺弥漫性肿大或结节性肿大，生化检验甲状腺功能正常，131I摄取率正常，血清TPOAb、TgAb阴性。(4)对照组，来自同期同地区社区健康人群，所有对照无急慢性疾病和炎症，无免疫疾病家族史，与患者无亲缘关系。本研究得到伦理委员会批准，每个研究对象均知情同意。各组与对照组性别、年龄比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。

表1 研究对象的性别和年龄分布

1.2方法

1.2.1DNA提取 所有研究对象均抽取肘静脉血2 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，24 h内送往实验室。用血液基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Blood DNA Kit，北京，中国)按说明书提取全基因组DNA。

1.2.2基因分型 采用限制片段内切酶法(RFLP)确定TLR4基因rs1927914(C/T,C是野生型)的基因型。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成(生工®Sangon Biotech)，上游引物：5′-ACG TCT AGT CTA GAG CAT CA-3′，下游引物5′-GGA GTC TAC AAG AGT TTG TG-3′。采用天根公司PCR试剂盒(2×Taq PCR MasterMix)和 TC-XP-G XP基因扩增仪按照实验步骤实行目标基因片段扩增。PCR反应条件：开始预变性94 ℃ 5 min，变性94 ℃ 30 s、退火54 ℃ 30 s、72 ℃延伸1 min循环35次，72 ℃延伸5 min。PCR产物经限制性内切酶NsiⅠ(Thermo)消化、通过2.5%琼脂糖凝胶电泳确定基因型。若等位基因为C，则被酶切为2段；若为T，则不能被酶切。所以当基因型为TT时，电泳显示1条条带，长340 bp；若基因型为CC，显示2条条带，长220、120 bp；若基因型为CT，显示3条条带，长340、220、120 bp。为了证实方法的准确度，抽取5%的标本进行基因片段测序(ABI PRISM 3730xl,测序试剂为BigDye terminator v3.1)，检测结果一致率达100%；与基因库中序列进行比对，序列相同。

2 结 果

2.1PCR产物酶切鉴定及测序结果 PCR产物酶切鉴定及测序结果，见图1、2。

M:Marker；1：CC基因型；2、4：TC基因型；3、5、6：TT基因型

图1 TLR4基因rs1927914位点酶切电泳图

图2 TLR4基因rs1927914位点T/C多态性测序结果

2.2Hardy-Weinberg平衡检验 TLR4基因rs1927914位点多态性的等位基因和基因型频率在所有受试者中都未偏离Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，本次研究人群具有群体代表性。

2.3基因型和等位基因的比较

2.3.1等位基因比较 TLR4基因rs1927914位点等位基因T和C，在GD组、HT组、SG组的分布，分别与对照组进行比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3.2基因型比较 TLR4基因rs1927914-T/C位点基因型(TT/TC/CC)在3种疾病中的分布，分别与对照组进行比较，经非条件Logistic回归计算其相关性。采用共显性、显性和隐性模式分析，3者对基因型的赋值方法分别为(1、2、3)、(1、1、3)和(1、3、3)。结果显示TLR4基因rs1927914位点在3种遗传模式下与GD、HT均无关联；而在该位点与SG的相关分析中，在隐性遗传模式下显示相关性，即TT基因型个体对SG的易感性显著增加(隐性遗传模式：OR=1.923，95%CI=1.025～3.609，P=0.040)，见表2～4。

表2 TLR4基因 rs1927914位点单核苷酸多态性与GD关联分析

表3 TLR4基因rs1927914位点单核苷酸多态性与HI关联分析

表4 TLR4基因rs1927914位点单核苷酸多态性与SG关联分析

3 讨 论

TLRs是一个介导天然免疫的跨膜信号传递受体家族，它通过识别病原相关的分子模式，激活受体后级联反应产生相关的免疫应答[4]。TLR4是人类发现的首个TLR相关蛋白。人类TLR4基因位于染色体9q33.1，全长11.6 kb，由4个外显子组成，编码800个氨基酸的Ⅰ型跨膜糖蛋白，多态位点位于TLR4基因的启动子区域，推测其多态性可能影响到基因的转录、翻译，进而改变TLR4 蛋白质的结构和功能，使机体对有害环境因素的反应产生变化，从而导致疾病的发生。

基于以上原因，有关TLR4基因rs1927914位点多态性与疾病的相关研究多有报道。徐翔等[5]探讨了中国北方汉族人群TLR4基因多态性与大动脉粥样硬化性脑梗死及脑动脉粥样硬化血管床选择性的关系，发现在中国北方汉族人中位点多态性与脑梗死相关，与血管床选择性不相关。而梁宝云[6]的研究则发现TLR4基因位点可能对男性缺血性脑卒中具有保护作用。张丽菊[7]应用1∶1匹配的病例对照研究，确定位点多态性与2型糖尿病之间无相关性。古联等[8]在对TLR4基因rs1927914位点多态性与汉族男性中风易感性的研究中，发现了阳性相关结果。印度有关该位点与糖尿病足和糖尿病视网膜病变关系的研究表明，两者之间无关联[9-10]。有关该位点多态性与癌症的研究也有报道，WENG等[11]收集了3 937例病例和7 382例对照关于TLR4基因多态性与浸润性前列腺癌相关的研究做了Meta分析，显示出阴性结果。

甲状腺疾病是一类环境因素、生活方式及多基因联合作用的病因复杂疾病。GD、HT、SG在人群筛查中比较常见。目前认为，这3种甲状腺疾病的发生除了与碘的摄入、吸烟、感染等外部因素有关外，都表现出强烈的遗传特点。为了探讨TLR4基因rs1927914位点多态性与甲状腺疾病之间的关系，以河北省沧州市甲状腺疾病调查人群为研究对象进行本研究。河北省沧州市东面临海，西接太行山，不同区域环境及饮食饮水中碘的差异很大，各地生活习惯也各有不同。本研究在研究对象的选择中，不仅获得了人群调查所得病例，同时在同地区同人群中选择同性别且年龄相近的人群做对照，很好地平衡了影响甲状腺疾病发生的一些外部条件，以突出单基因在疾病发生中的作用。

本研究未发现TLR4基因rs1927914-T/C位点多态性与GD和HT的发病风险存在关联，而在该基因位点突变与SG的基因型相关分析中，发现其隐性遗传模型与疾病有关联，即TT基因型与SG病变呈正相关。其研究稳定性和作用机制还需进一步研究。曾有研究报道有关感染与甲状腺疾病发生的作用机制。刘奕婷等[12]报道幽门螺杆菌感染与自身免疫性甲状腺炎存在相关性； MORI等[13]指出肠道内菌群的失调可造成肠道免疫屏障受损，从而影响肠外免疫系统并参与HT的发生；DESAILLOUD等[14]认为是高度同源病毒肽段通过分子模拟机制诱发免疫反应，导致TLRs激活机体固有免疫和适应性免疫，从而损伤甲状腺细胞。SANTANA等[15]观察到TLR4基因rs1927914携带T等位基因，增加了血清中白细胞介素(IL)-1β和IL-17的水平，而IL-1β对于增强T细胞特异性免疫反应至关重要。因此，笔者推测rs1927914位点的多态性可能影响到某些重要的细胞因子的生产水平，进而改变了免疫系统对感染等外界环境因素的反应调控作用，从而影响到SG的发生。

尽管本研究发现了TLR4基因rs1927914位点多态性与SG相关，但本研究也存在一定的局限性。考虑到甲状腺疾病的发生还与地理环境、种族差异、遗传异质性等有关，也不能完全排除吸烟、喝酒等其他一些混杂因素的影响；此外，单核苷酸多态性与疾病在统计学上的关联和真正的因果联系之间还有很长的距离，仍需要了解基因如何参与复杂的人体免疫系统调控最终影响疾病的发生。

综上所述，本研究发现了TLR4基因rs1927914TT基因型与SG的相关性，提示该基因在该病发生中的重要性。目前有关TLR4基因rs1927914位点多态性与甲状腺疾病相关性研究报道较少，需要进一步通过不同群体进行研究，来揭示基因突变在疾病发生、发展中的作用及作用机制，为基于遗传学背景的个性化治疗和人群预防奠定基础。