曾凯宏，王 元，邓 波，余雪梅，宋 怡，周 雪，黄璐娇

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院临床营养科，成都 610072；2.电子科技大学医学院，成都 610054)

本课题组前期研究结果表明，在糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)早期视网膜微血管病变之前即可检测到视网膜Muller细胞凋亡[1-3]。SILVA等[4]研究DR早期神经细胞微小RNA(miRNA，miR)表达时发现，miR-29b在DR早期视网膜Muller细胞凋亡中起重要作用。miR-29b通过转录因子特异蛋白1(SP1)参与DR早期视网膜Muller细胞凋亡。白藜芦醇是非黄酮类多酚化合物，近年发现白藜芦醇对DR有防护效应，白藜芦醇可改善C57BL/6 DR小鼠视网膜血管渗漏、微血管周细胞丢失及上调表皮生长因子受体(VEGF)表达[5-7]，证实白藜芦醇对DR晚期视网膜微血管病变有防护作用。最近，白藜芦醇经miR通路起作用的机制已被关注。本研究通过建立糖尿病大鼠动物模型，研究白藜芦醇对糖尿病早期大鼠视网膜Muller细胞凋亡及视网膜组织中miR-29b和SP1表达的影响，为指导人们通过膳食途径防治DR提供科学依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物 清洁级成年Sprague-Dawley(SD)大鼠购于四川省医学科学院·四川省人民医院实验动物研究所。

1.2试剂 白藜芦醇纯品、链脲佐菌素(STZ)购于美国Sigma公司。

1.3方法

1.3.1糖尿病动物模型建立及实验分组 实验前大鼠禁食12 h，用STZ诱导建立糖尿病大鼠动物模型，临用前用0.1 mol/L (pH 4.2) 的柠檬酸缓冲液配制成2% STZ溶液，按60 mg/kg一次性左下腹腔注射，注射后72 h检测定性尿糖和血糖，用尿糖试纸测尿糖达(+++)以上，尾静脉采血测血糖浓度大于16.7 mmol/L即为模型建立成功。将糖尿病大鼠分为3组：糖尿病未治疗组，低剂量(5 mg·kg-1·d-1)白藜芦醇干预糖尿病组，高剂量(10 mg·kg-1·d-1)白藜芦醇干预糖尿病组。健康大鼠也分为3组：健康对照组，低剂量(5 mg·kg-1·d-1)白藜芦醇干预健康对照组，高剂量(10 mg·kg-1·d-1)白藜芦醇干预健康对照组，每组大鼠68只。所有大鼠在整个实验时间内都可以自由获取食物和水。每天监测大鼠情况，每周从尾静脉抽取血液，通过标准实验室方法测定血浆葡萄糖和果糖胺水平。

1.3.2TUNEL染色联合免疫荧光标记 摘眼球后立即在4%多聚甲醛中固定2 h。去除角膜和晶状体，将剩余的眼杯置于相同的固定剂中4 h。使用试剂盒(TdT-FragEL DNA Fragmentation Detection Kit;Oncogene,Boston,MA)在7 μm视网膜切片上进行TUNEL染色，然后用20 μg/mL蛋白酶K孵育，用TdT/dUTP反应混合物在37 ℃孵育1 h进行DNA片段标记，然后使用PBS洗3次。用含有5%正常山羊血清的封闭缓冲液封闭1 h。将切片在封闭缓冲液中与兔抗大鼠SP1抗体(1∶1 000,美国Sigma公司)一起孵育1 h。在避光、室温条件下孵二抗(1∶200,美国Chemicon International公司)40 min。进一步冲洗后，用盖玻片覆盖切片。通过将切片暴露于DNA酶中进行DNA断裂的阳性对照实验，阴性对照省略了TdT/dUTP标记混合物，导致无染色。在Olympus共激光共聚焦扫描显微镜中观察切片。计数视网膜内核层(INL)中TUNEL阳性细胞数。使用OpenLab软件测量INL的面积。

1.3.3实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)分析 qRT-PCR检测miR-29b和SP1基因表达，分别设计miR-29b和SP1基因引物及TaqMan荧光探针(由大连宝生物公司合成)。引物序列为：miR-29b正向引物5′-CGT AGC ACC ATT TGA AAT CAG TGT T-3′，反向引物5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′；SP1正向引物5′-AGG TGC ACC AGC TTC CAG GCC TG-3′，反向引物5′-CCA GGT CCA TGA AGG CCA AGT TG-3′；RPL13A正向引物5′-AAG CCT ACA AGA AAG TTT GCC TAT C-3′，反向引物5′-TGT TTC CGT AGC CTC ATG AGC-3′。用常规酚/氯仿法提取大鼠视网膜微血管周细胞(RMPs)的mRNA，进行qPCR反应，反应体系25 μL：2×TaqMan University PCR混合液12.5 μL，10 μmol/L正、反向引物各0.5 μL，10 μmol/L TaqMan探针0.3 μL，100 ng/μL DNA 0.2 μL，同时设立内对照RPL13A基因，反应在ABI Prism 7000荧光定量PCR仪上进行。反应条件为：93 ℃ 2 min；93 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，共40个循环。采用低循环数(Ct)比较法计算目的基因的相对拷贝数与表达水平。

1.3.4Western blot分析 提取总蛋白，使用Bradford方法(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)测定蛋白质浓度。将蛋白(60 μg)在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上分离，然后电泳转移到硝酸纤维素膜(Bio-Rad,USA)。通过将膜与5%脱脂奶在三乙醇胺缓冲盐溶液(TBS)加0.1%吐温(TBST)中孵育60 min来阻断非特异性位点。然后分别用以下一抗SP1(1∶1 000,美国Sigma公司)、GAPDH(1∶2 000，美国Sigma公司)，4 ℃孵育过夜。洗涤后，将膜与辣根过氧化物酶(HRP)共轭二抗一同孵育60 min。使用Bandleader 3.0软件通过光密度测定分析相对表达水平。然后将每个蛋白的光密度读数计算用于归一化的GAPDH强度读数的比率。

2 结 果

2.1白藜芦醇对糖尿病大鼠血浆葡萄糖和果糖胺水平的影响 糖尿病大鼠血浆葡萄糖和果糖胺水平与年龄匹配的健康对照组大鼠相比均显著升高(P<0.05)；在所有时间点，白藜芦醇(5、10 mg·kg-1·d-1)处理的糖尿病大鼠血浆葡萄糖和果糖胺水平均显著低于糖尿病未治疗组大鼠(P<0.05)；而经白藜芦醇(5、10 mg·kg-1·d-1)处理的健康大鼠的血浆葡萄糖和果糖胺水平较健康对照组大鼠未发生明显改变(P>0.05)，见表1、2。

表1 白藜芦醇对糖尿病大鼠血浆葡萄糖水平的影响

a：P<0.05，与健康对照组比较；b：P<0.05，与糖尿病未治疗组比较

A～D：干预后1、3、5、7个月后TUNEL染色联合SP1免疫荧光染色图；E：视网膜INL中TUNEL阳性细胞计数结果；a:P<0.01，与糖尿病未治疗组比较；b:P<0.05，与低剂量白藜芦醇干预糖尿病组比较

图1白藜芦醇对DR大鼠细胞凋亡及SP1分布改变的影响

2.2白藜芦醇对糖尿病大鼠视网膜细胞凋亡的影响 在STZ诱导和白藜芦醇治疗后的1、3、5和7个月时，糖尿病未治疗组和低、高剂量白藜芦醇(5、10 mg·kg-1·d-1)干预组大鼠视网膜中均可观察到TUNEL阳性信号，TUNEL阳性信号主要位于视网膜的INL。而在健康对照组和低、高剂量白藜芦醇干预健康对照组大鼠视网膜中均未观察到TUNEL阳性信号。与糖尿病未治疗组相比，低、高剂量白藜芦醇(5、10 mg·kg-1·d-1)干预糖尿病组大鼠视网膜INL中TUNEL阳性细胞数量显著降低(P<0.01)。在研究的4个时间点，高剂量白藜芦醇干预糖尿病组与低剂量白藜芦醇干预糖尿病组比较，INL中TUNEL阳性细胞的数量显著降低(P<0.05)，见图1。

表2 白藜芦醇对糖尿病大鼠血浆果糖胺水平的影响

a：P<0.05，与健康对照组比较；b：P<0.05，与糖尿病未治疗组比较

A:干预后1个月；B:干预后3个月；C:干预后5个月；D:干预后7个月；a:P<0.01，与正常对照组比较；b：P<0.05，c：P<0.01，与糖尿病未治疗组比较；d：P<0.05，与低剂量白藜芦醇干预糖尿病组比较；1：健康对照组；2：低剂量白藜芦醇干预健康对照组；3：高剂量白藜芦醇干预健康对照组；4：糖尿病未治疗组；5：低剂量白藜芦醇干预糖尿病组；6：高剂量白藜芦醇干预糖尿病组

图2白藜芦醇对DR大鼠miR-29b表达的影响

A:干预后1个月；B:干预后3个月；C:干预后5个月；D:干预后7个月；a:P<0.01，与正常对照组比较；b：P<0.01，与糖尿病未治疗组比较；c:P<0.05，与低剂量白藜芦醇干预糖尿病组比较;1：健康对照组；2：低剂量白藜芦醇干预健康对照组；3：高剂量白藜芦醇干预健康对照组；4：糖尿病未治疗组；5：低剂量白藜芦醇干预糖尿病组；6：高剂量白藜芦醇干预糖尿病组

图3白藜芦醇对DR大鼠SP1 mRNA表达的影响

A：干预后1个月；B：干预后3个月；C：干预后5个月；D：干预后7个月；a:P<0.01，与正常对照组比较；b：P<0.01，与糖尿病未治疗组比较；c:P<0.05，与低剂量白藜芦醇干预糖尿病组比较1：健康对照组；2：低剂量白藜芦醇干预健康对照组；3：高剂量白藜芦醇干预健康对照组；4：糖尿病未治疗组；5：低剂量白藜芦醇干预糖尿病组；6：高剂量白藜芦醇干预糖尿病组

图4白藜芦醇对DR大鼠SP1蛋白表达改变的影响

2.3白藜芦醇对糖尿病大鼠视网膜中miR-29b表达的影响 在干预后1、3、5和7个月，与健康对照组大鼠比较，糖尿病未治疗组大鼠视网膜中miR-29b的表达显著降低(P<0.01)。与未治疗糖尿病组比较，4个时间点的低、高剂量白藜芦醇干预糖尿病组miR-29b表达均上调至少1.2倍(P<0.05)。在4个研究时间点，高剂量白藜芦醇干预糖尿病组的miR-29b表达水平均高于低剂量白藜芦醇干预糖尿病组(P<0.05)；健康对照组大鼠视网膜中的miR-29b表达未被白藜芦醇干预改变(P>0.05)，见图2。

2.4白藜芦醇对糖尿病大鼠视网膜中SP1表达的影响 在干预1，3，5和7个月后，与健康对照比较，糖尿病视网膜中SP1 mRNA表达分别增加2.1、2.2、2.3和2.3倍(P<0.01)；SP1蛋白表达分别增加2.0、2.1、2.1和2.1倍(P<0.01)。与未治疗糖尿病组比较，4个时间点的低、高剂量白藜芦醇干预糖尿病组SP1 mRNA和蛋白表达均明显降低(P<0.01)。在4个时间点，高剂量白藜芦醇干预糖尿病组的SP1 mRNA及蛋白表达水平均低于低剂量白藜芦醇干预糖尿病组(P<0.01)。健康对照组大鼠视网膜中的SP1表达未被低、高剂量白藜芦醇干预改变(P>0.05)，见图3、4。

3 讨 论

糖尿病发展成DR是一个缓慢的过程，一般需要5～6年的时间。糖尿病明确诊断、眼底出现改变之前的阶段被称作DR的临床前期。研究发现，DR的临床前期是先有视网膜组织代谢的损害，然后才是组织学或检眼镜下可见的血管异常。研究认为，视网膜神经元和神经胶质细胞功能异常出现最早。Muller细胞是视网膜的主要神经胶质细胞。Muller细胞的功能是维持视网膜的稳态和完整性。以往研究还发现，miR-29b的下调可能是DR诱导视网膜神经损伤的主要因素[7]。本研究中，笔者在STZ注射后的4个时间点都观察到了视网膜miR-29b的下调表达。

目前国内外关于DR防护的研究不胜枚举，多数研究证明，高级糖基化终产物抑制剂、蛋白激酶C抑制剂、肾素-血管紧张素系统抑制剂及一些抗氧化剂等对DR有防护效应，但对DR早期视网膜损伤防护效果不明显[4-6]。白藜芦醇具有很多生物学效应，例如抗氧化、抗炎、抗癌、抗凝血和心脏保护作用[8-12]。迄今为止，已有大量研究证实白藜芦醇对糖尿病和DR有保护效应[13-16]，但白藜芦醇对DR早期视网膜Muller细胞损伤的作用如何尚未见报道。在本研究中，笔者观察了白藜芦醇抗DR诱导的视网膜Muller细胞凋亡作用，结果表明，采用白藜芦醇可有效抑制糖尿病大鼠血浆葡萄糖和果糖胺水平的升高，白藜芦醇可有效地抑制体内STZ诱导的INL中视网膜Muller细胞胞体所在层的细胞凋亡。此外，本研究表明，糖尿病诱导的miR-29b下调和SP1上调可被白藜芦醇抑制。这些发现表明白藜芦醇是DR的潜在治疗选择，miR-29b/SP1途径可能在白藜芦醇的抗凋亡机制中发挥作用。