黄蓉 邢怡桥 李敏

视神经在受到包括青光眼/外伤性视神经病变(traumatic optic neuropathy，TON)以及各种缺血性、遗传性、神经性疾病等的视神经损伤后通常无法

再生，继而导致不可逆的视功能丧失[1]。近年来，受损视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)保护、视神经再生修复的基础研究方面有颇多进展。本文将对最近在视神经再生方面的基础研究进展综述，以期从促进RGCs轴突再生的相关机制入手，为视神经再生提供合理的理论基础，有助于未来进一步研发促进神经中枢神经和轴突再生的方法。

1 视神经损伤难以自身修复的机制

视神经是RGCs轴突的延续，同时也属于中枢神经系统(central nervous system，CNS)，RGCs轴突不能再生的机制可能为视神经损伤后RGCs自身的凋亡、缺乏神经营养因子、成熟RGCs及其轴突丧失自身再生能力、缺乏合适的再生刺激信号、与轴突再生相关基因表达下调以及视神经损伤局部的抑制性细胞外微环境等[1-3]。

同时，视神经损伤后激活视网膜胶质细胞，包括少突胶质细胞、星形胶质细胞以及视网膜小胶质细胞(retinal microglia cells，RMGs)，从而上调多种轴突生长抑制因子，即髓磷脂相关抑制分子如髓鞘相关糖蛋白(myelin-associated glycoprotein，MAG)、少突胶质细胞-髓鞘糖蛋白(oligodendrocyte-myelin glycoprotein，OMgp)以及轴突生长抑制剂(neurite outgrowth inhibitor-A，Nogo-A)等的表达[2]，促进由硫酸软骨素、蛋白多糖组成的胶质瘢痕形成，进一步形成了抑制轴突延伸的物理性屏障[4]。

此外，轴突损伤引起RGCs凋亡会通过上调P53信号通路下游因子，增加RGCs超氧化物水平，进一步引起RGCs凋亡[5]。

2 视神经再生的基础研究进展

视神经损伤后修复的思路包括保护受损RGCs防止其死亡、诱发并促进损伤RGCs轴突再生、再生轴突到达正确的靶组织并重建突触联系以及视觉功能恢复4个步骤[6]。而近期视神经再生方面基础研究所取得的进展，重点包括通过适当炎症刺激、提供神经营养因子、激活成熟RGCs内在能力再生、正确引导轴突克服抑制性细胞外环境等方面。

2.1炎症刺激诱导视神经再生Benowitz等[1]、Leibinger等[7]研究显示晶状体损伤及注射酵母多糖等方式能通过引起眼内炎症而诱导受损的RGCs显著再生，而机制可能与RGCs内在生长状态的变化有关：晶状体β、γ蛋白通过刺激星形胶质细胞和Müller细胞，后两者持续分泌睫状神经营养因子(ciliary neutrophic factor，CNTF)和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)，上述2种胶质细胞源性细胞因子(glia-derived neurotrophic factor，GDNF)是促进RGCs存活和轴突再生的主要因子。Pasquin等[8]研究显示，CNTF基因或CNTF/LIF基因敲除小鼠晶状体损伤后促生长效果明显下降，也说明CNTF、LIF在炎症介导抑制轴突再生中必不可少。其通过磷脂酰肌醇3-激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol 3-kinase/mammalian target of rapamycin，P13 K/mTOR)、丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(mitogen-activated protein kinase/extracellular signal regulated kinase，MAPK/ERK)等途径调控下游调节蛋白合成和轴突生长细胞因子的释放引起RGCs再生[9]。

此外，癌调蛋白(oncomodulin，Ocm)对介导炎症刺激促进对视神经再生起到了至关重要的作用[10]，Ocm是蛋白质相对分子质量为11 000的钙结合蛋白，在玻璃体和视网膜激活的巨噬细胞、中性粒细胞中高度表达。炎性刺激12～24 h后，Ocm水平迅速升高，并通过细胞内信号传导的第二信使环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)，与RGCs高亲和性受体结合[11]。因此，炎症引起的 CNTF、LIF、IL-6相关因子释放和包括JAK/STAT3、PI3K/AKT/mTOR在内的信号通路的调控被确认为是促视神经再生的关键调控因素[8，12]。

2.2提供外源性神经营养因子RGCs依赖视神经逆行轴浆运输，从靶组织获取各类营养因子。其中，神经营养因子(neurotrophic factors，NTF)是在机体发育过程中介导神经元细胞生长、分化、存活和突触稳定的蛋白，包括神经营养家族、GDNF家族和其他生长因子[3]。一旦视神经损伤引起来自靶组织的营养供应部分或完全阻断，会导致视神经溃变和RGCs凋亡[6]。

2.2.1神经营养家族神经营养家族包括4种蛋白多肽，即脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BNDF)、神经生长因子、营养因子4/5(neurotrophin 4/5，NT4/5)和NT3，其通过与RGCs酪氨酸激酶受体结合发挥不同程度RGCs保护作用[10]。在实验性视神经损伤模型中，Osborne等[13]研究表明BNDF、NT4/5等神经营养物质眼内注射会导致RGCs存活时间暂时增加，但最终呈现下降趋势；且同时抵消了眼内炎症对视神经再生的促进作用。因而其神经保护作用短暂，且不能阻止RGCs最终凋亡。

2.2.2GDNF家族GDNF家族包括CNTF和LIF，其是介导眼内炎症、促使轴突再生的关键因素，两者均通过与含信号转导受体的糖蛋白130结合来发挥作用[8]。Cui等[14]和Wen等[15]研究显示视神经损伤后，GDNF家族在刺激轴突长距离再生和促进轴突存活方面比神经营养家族更有效。而Pemnet等[16]研究显示视神经损伤后CNTF和LIF高表达，通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制轴，调控发育过程中的调节蛋白合成和轴突生长的因子mTOR来保护RGCs，同时促进轴突再生。此外，Leibinger等[7]、Kurimoto等[11]研究表明CNTF的保护作用与cAMP升高水平、眼内炎性刺激和STAT3通路的激活状况密切相关。

2.2.3其他生长因子其他生长因子则包括肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)等[2-3]。Nakamura等[17]研究显示HGF在体外和体内均具有增加神经元存活和轴突再生的作用。Soto等[18]研究发现FGF通过上调促进轴突生长的促蛋白生长相关蛋白-43(growth associated protein-43，GAP-43)发挥作用。

2.3阻断视神经再生的细胞内抑制性信号在发育过程中，神经元轴突被特定信号导向靶组织。胚胎RGCs生长能力非常强，而发育晚期为稳定突触间相互联系，中枢神经元轴突的再生能力下降，但保留对轴突切断的敏感性[9，19]，其可能机制是出生后早期基因表达发生变化，促使成熟CNS抑制性环境的形成以及发育依赖性的生长能力的下降[1，10]。

2.3.1调控特定基因的表达对于成熟RGCs而言，mTOR通路的激活具备促进神经保护和轴突再生的能力，与细胞因子信号传导抑制因子-3(suppression of cytokine signaling 3，SOCS3)和PTEN基因(phosphatase and tensin homologue，PTEN)的抑制下调密不可分[20]。因此，损伤后上调或下调特定基因的表达可能是增加轴突再生能力的方法之一[4]。

如上所述，SOCS3在成熟RGCs中表达上调，并通过抑制JAK/STAT3信号通路调控Ocm介导的轴突生长来下调RGCs自我再生能力。因此，SOCS3被认定是抑制轴突再生的关键负调节因子[21]。而RGCs中特定SOCS3基因敲除能促进轴突再生并强化CNTF眼内注射的保护作用，再一次表明SOCS3是视神经损伤后CNTF介导轴突再生的细胞内抑制信号[22-23]。

PTEN是与PI3K/AKT/mTOR信号通路相关的另一种内源性轴突再生负调节因子，目前已被证实调控PTEN可增强神经元自我再生能力，以促进损伤后RGCs的轴突再生[24]。此外，PTEN基因敲除可重新激活PI3K/AKT/mTOR通路，同时强化炎症刺激诱导视神经再生的作用[25]。因此，PTEN敲除结合炎性刺激以及cAMP类似物的添加对体内轴突再生具有协同作用。理论上而言，多重敲除PTEN、SOCS3基因和抑制外源性CNTF表达可共同促进突再生[4，20]，但临床实际操作中目前尚无法做到条件性基因敲除，因此此种方式目前未得到很好的应用。

2.3.2AAV2载体介导基因治疗基因治疗是促进视神经再生的另一可观手段，作为目前眼科基因治疗应用最广泛的转基因载体，重组腺相关病毒2(adeno-associated virus2，AAV2)载体通过治疗基因取代病毒编码序列并转染宿主细胞，以沉默PTEN基因表达，进而对RGCs存活和轴突再生体现出良好促进作用[26]。同时基因具有长时间表达的特点，因此通过玻璃体内注射靶向重组AAV2达到视神经保护的作用可能是未来的研究方向[26-27]。

2.3.3调控相关转录因子Krtippel类因子(Krtippel-like factors，KLFs)是一类翻译因子，Moore等[28]研究显示KLFs调节RGCs发育和再生的发育依赖性调节因子。Blackmore等[29]研究证实在RGCs发育过程中，胚胎RGCs轴突生长的抑制基因KLF-4和KLF-9表达上调，而促生长基因KLF-6和KLF-7表达下调，推测这可能与RGCs发育过程中表现出的发育性轴突生长能力丧失有关。Benowitz等[1]、Moore等[28]研究表明，敲除KLF-4基因后会通过调控JAK/STAT3信号通路促使视神经损伤后的神经元生长和轴突再生。此外，Qin等[30]研究显示由CNTF或SOCS3沉默引起的KLF-4缺失同样会促使轴突再生显著增加。

2.4细胞内信号通路的激活wnt/β-catenin(Wnt)通路是机体内用来调控细胞增殖的基础通路，用以维持胚胎和组织发育的机体内稳态，因此是视网膜发育、轴突生长的重要信号传导通路[31]。在发育性视网膜中，经典Wnt配体Wnt3a、4、7b等能诱导轴突生长以及特异性调节RGCs轴突靶向投射。Patel等[32]研究显示，通过玻璃体内注射Wnt3a，发现视神经损伤实验组RGCs存活率和轴突再生明显增加，可能与其调控经典Wnt信号通路激活转录因子STAT3有关。Patel等[33]研究显示，图形视网膜电图(pattern electroretinography，P-ERG)检查中wnt3a眼内注射动物比对照组表现出更高的振幅，也进一步验证了此观点。

2.5改善抑制性视神经细胞外微环境除了上述影响轴突再生的细胞内抑制因子外，Shum等[3]、Chun等[34]研究表明，众多细胞外因子共同作用为轴突再生营造了不利的细胞外微环境。因此，改善不利细胞外微环境在视神经再生中则尤为重要。

2.5.1减少抑制性蛋白质的合成视神经损伤后，受损的RGCs轴突暴露在星形胶质细胞和少突胶质细胞变性并释放的抑制性蛋白质(如Nogo-A，MAG和OMgp)中[2，35]。大量实验表明，Nogo-A、MAG和OMgp通过结合Nogo-66受体(Nogo receptor-1，NgRl)，并通过Ras同源基因A/rho相关蛋白激酶(RhoA/ROCK)信号途径，诱导生长锥塌陷并抑制神经元生长[4，10，16，34]，而Nogo受体基因缺失或基因敲除会诱导中等程度的视神经再生[36]。损伤后活化的视网膜星形胶质细胞和RMGs肥大增生，在损伤部位形成胶质瘢痕，分泌抑制细胞外基质(extracellular matrix，ECM)分子，包括硫酸软骨素蛋白多糖(ehondroitin sulfate proteoglycans，CSPG)和信号素，为轴突再生提供机械性屏障[37]。Kwok等[38]研究显示，用细菌软骨素ABC酶处理的方法，可降解硫代糖胺聚糖的侧链，改善ECM瘢痕环境、促进轴突再生。

轴突细胞外抑制剂的作用信号通路主要集中于pA/p相关蛋白激酶(pA/ROCK)通路的激活，通过激活LIM蛋白激酶和丝切蛋白导致肌动蛋白解聚，进而肌动蛋白丝降解诱导生长锥失活或崩溃[39]。此外，视神经损伤后pA信号的激活也能通过调控促存活蛋白(如AKT[26])合成促进轴突再生，并强化炎症刺激在轴突再生中的促进作用[40]。Ohtake等[37]研究表明，ROCK失活能克服髓磷脂和CSPG在体外的抑制作用，使其在体内RGCs中再生。近期Shaw等[41]研究显示，ROCK/去甲肾上腺素转运蛋白(Net)抑制剂在体内视神经损伤后促进RGCs存活和轴突再生，该研究表明AR-13324具有神经保护作用和轴突再生作用，而含有AR-13324的滴眼液局部给药，具有非侵入性、易吸收的特点，通过对ROCK/Net的抑制或许是克服视神经再生障碍的又一新型治疗方法。

2.5.2调节细胞离子浓度视神经损伤后最早发生的现象之一是流动锌(Zn2+)在无长突细胞中的快速增加，正常情况下[42]，Zn2+多集中在靶向神经元突触小泡中，并在调节视网膜突触信号传递中起关键作用。Ripps等[43]研究表明，视神经受损后1 h内Zn2+水平在视网膜无长突细胞中快速升高，在24 h达峰值，并转移至受损RGCs。近期Li等[42]研究显示Zn2+的螯合作用能使许多受损的RGCs得以存活数月、促进轴突再生，使得视神经损伤后治疗时间窗延长。上述结果表明，视网膜Zn2+失调将是影响RGCs存活和再生的前提与关键因素，考虑到Zn2+螯合剂已被临床用于其他目的，视神经损伤后玻璃体内注射Zn2+螯合剂可能是视神经再生的可能治疗策略[42]。

另一视神经损伤后的现象则是细胞外钙离子(Ca2+)急剧增加，在机体损伤后28 d左右细胞内Ca2+水平达到高峰，通过快速Ca2+通道介导流入RGCs轴突并激活钙蛋白酶在轴突退化过程中发挥作用[44]。钙通道阻滞剂早已被证明能减弱视神经损伤后的急性轴突退化。此外，也能通过削弱钙蛋白酶活性并通过激活视网膜AKT释放促存活信号，在视神经损伤后改善RGCs存活和轴突再生[45]。因此，单独给予钙通道阻断剂或与上述任何其他抑制剂联合治疗，可为未来视神经退变患者的治疗提供新的思路。

2.6引导再生轴突到达正确的靶组织并重建突触联系胚胎发育时期的RGCs轴突组成的视神经，半数在EphrinB2配体引导下于视神经交叉处保持同侧走行[46]。为了保正视觉空间定位，RGCs通过EphrinB2配体的浓度梯度来引导轴突精确投射到外侧膝状核、上丘脑以及特点大脑皮质区域[1，34]。Abate等[47]研究显示，EphrinB2配体信号在成熟哺乳动物视觉系统中稳定表达，并在视神经损伤后上调。但在轴突再生期间调控信号及其受体表达的机制尚不清楚，需要进一步研究[48]。De Lima等[25]研究显示，通过酵母聚糖、cAMP类似物和PTEN基因敲除的联合治疗，能促使部分再生RGCs轴突延伸，并穿过视交叉进入小鼠模型的外侧膝状体中。而PTEN、SOCS3、CNTF基因联合敲除虽然刺激了视神经损伤部位的轴突再生，但只有少数轴突成功地跨越了视神经交叉[1，49]。Li 等[50]研究进一步发现，当视交叉以上部分的视神经损失时，PTEN、SOCS3、CNTF基因联合敲除的方法能促进上丘脑中轴突再生并恢复突触后反应；此外，c-myc癌基因的过表达同样增强了上述效应，并允许较多轴突到达视束中[51]。

3 小结

视神经损伤后有众多信号通路、蛋白质和转录因子等参与，表明促进视神经再生的作用靶点并不单一。深入研究包括增强RGCs再生能力、改善外在生长抑制环境的因素、引导再生轴突到达正确的靶组织，并重建突触联系在内的联合治疗，从而实现功能视觉恢复是未来研究热点。

近年来，视神经再生研究取得了巨大突破，已探清成熟RGCs轴突不能再生的分子机制，且研究出促进视神经损伤后RGCs存活和轴突短距离再生的方法。理论上虽有使患者恢复光感的可能，但视觉功能性恢复需要更多的RGCs存活、更长距离的轴突再生以及后者精确投射至视觉中枢，并和中枢神经元重建准确的突触联系。使得研发提高靶组织可塑性的方法任重而道远，但最终恢复视神经损伤患者的视觉功能将指日可待。