彭 馨,徐鹏飞,汤 宇,杜 浩,袁 露,孟 勇



ESR技术应用于逆胶束酶体系性能的研究

彭 馨*,徐鹏飞,汤 宇,杜 浩,袁 露,孟 勇

(湖南师范大学化学化工学院,石化新材料与资源精细利用国家地方联合工程实验室,湖南师范大学化学生物学及中药分析教育部重点实验室,有机功能分子组装与应用湖南省重点实验室,湖南 长沙 410081)

采用鼠李糖脂构建逆胶束体系,并利用电子自旋共振(ESR)技术研究了鼠李糖脂逆胶束及鼠李糖脂逆胶束酶体系的性能.采用ESR光谱技术计算得出逆胶束体系中超精细分裂常数变化,研究表明鼠李糖脂在正己烷中的临界胶度为0.07mmol/L.通过分析ESR光谱中旋转相关时间的变化,探究电子自旋探针在逆胶束中运动受阻和翻转所需时间的情况同时,ESR光谱的峰值体现了样品中自由基含量的多少.通过对比逆胶束体系、逆胶束酶体系以及逆胶束酶-苯酚体系的ESR光谱,结果表明鼠李糖脂逆胶束-苯酚体系的自由基最多.通过研究对16-氮氧自由基硬脂酸对两个体系作用,推测出电子自旋探针自由基团定位于逆胶束水核中,并且推断电子自旋探针位于水核的边缘区域,即结合水水层.该研究为逆胶束酶体系的应用提供了坚实的理论基础.

鼠李糖脂；逆胶束；电子自旋共振；探针；16-氮氧自由基硬脂酸

近年来,逆胶束酶体系性能的研究受到广泛的关注.目前研究逆胶束酶体系的手段很多,其中应用电子自旋共振法(ESR)研究逆胶束酶体系中各组分缔合情况以及酶降解性能是一种非常有效的方法.ESR技术能够探索物质微观结构和运动状态.其研究的原理为:一个未配对电子由低能级到高能级时自旋取向的改变.当顺磁性的物质的自旋电子处于外加磁场时,吸收了足够的电磁辐射后,会发生电子的自旋共振现象.ESR波谱仪能够检测出特定的参数,可以通过参数及线性精确地进行分析,获取不成对电子能态以及所处的位置等信息[1].

采用ESR技术过程中,探针能够与逆胶束体系接触,从而检测逆胶束体系各种性能参数.ESR技术中需要采用氮氧自由基硬脂酸为探针.从ESR光谱中可以求出旋转相关时间,进而探究逆胶束中各组分的聚合状态,越大说明探针分子的运动受阻,表明微粘度越大.同时,还能够从ESR光谱中求出超精细分裂常数N,可以表征探针所处位置的极性大小,N值越大微极性越大.其值对于所处的环境非常敏感,当达到表面活性剂的临界胶束浓度时,超精细分裂常数会降低,自旋探针从一个强极性的连续相转变到较小极性的胶束表面.ESR光谱的序参数与超精细分裂常数N类似,序参数越大,探针分子运动越慢.ESR光谱中的信号强度代表在共振条件下样品所吸收的总能量,即信号强度与样品中的自由基含量数目成正比[2-10].

目前,ESR技术在检测蛋白质结构、自由基和光敏催化反应中的应用已经得到了验证.逆胶束酶体系是一种油包水的结构,酶分子处于水核中.探究逆胶束酶体系的微观性能在逆胶束酶体系的应用中起着至关重要的作用.本研究采用生物表面活性剂鼠李糖脂单糖脂(RL)构建逆胶束体系,采用16-氮氧自由基硬脂酸(16-DSA)作为探针,研究逆胶束辣根过氧化物酶(HRP)体系的微观性能.对逆胶束酶体系的微观结构进行深入研究中降解污染物的研究做了准备工作.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 探针:16-氮氧自由基硬脂酸,购自sigma公司;辣根过氧化物酶,购自sigma公司;鼠李糖脂单糖脂,实验室自制.正己烷,氯仿,苯酚均为分析纯.

1.1.2 仪器 水浴恒温振荡器(WHY-2);超声波清洗仪;pH计(PHS-2F,上海雷磁仪器厂);HZQ-C空气浴振荡培养箱;Bruker EMX-EPR型电子自旋共振仪.

1.2 方法

1.2.1 逆胶束酶体系制备 按一定比例将RL与溶剂正己烷混合,将一定浓度的辣根过氧化物酶溶于水中,混合均匀后注入有机相中.放入震荡器中充分震荡10h左右之后静置24h.

1.2.2 ESR样品制备 将一定量的16-DSA溶于氯仿中,混合均匀形成0.4mmol/L的溶液.将探针与逆胶束酶体系混合至试管中,室温条件下在摇床中震荡10h之后,采用25˚C水温进行水浴24h.再将样品注入样品管中测定ESR光谱.

1.2.3 ESR中参数计算 (1)超精细分裂常数的计算 超精细分裂常数N的计算方法根据探针的不同而不同.由于本章节实验采用的探针为16-DSA,超精细分裂常数的算法即为ESR光谱中两个最值之间距离的二分之一[11],即N为低场峰到高场峰距离的1/2.对3组平行实验进行计算.

(2)旋转相关时间的计算

旋转相关时间的计算如下式[11]:

(2)

当<3ns时,采用式(2).

式中:△为中央峰谱线宽度;h为中央峰高度;+1为低场峰高度;-1为高场峰高度.

2 结果与讨论

2.1 不同RL浓度逆胶束ESR分析

考察不同RL浓度对超精细分裂常数的影响,其影响曲线如图1所示.设置RL浓度从0.03mmol/L逐渐升高至0.07mmol/L.当浓度从0.03mmol/L升高到0.05mmol/L时,N的值保持稳定.当浓度继续上升,N值突然明显上升,而当浓度升至0.07mmol/L时,N值开始下降.因此可以推测出0.07mmol/L是RL在正己烷中的临界胶束浓度.

RL浓度对旋转相关时间的影响如图2(A)所示.从整体上看,当RL浓度从0.03mmol/L升高至0.07mmol/L时,旋转相关时间有下降的现象,说明逆胶束体系微粘度整体上是下降的.从结果可以看出,当表面活性剂浓度高于CMC时,旋转相关时间有所下降.据相关文献中报道,X-DSA可能分布在胶束的水核中[12-15].

纵观RL浓度对超精细分裂常数和旋转相关时间的影响,当RL浓度为0.05 ~0.07mmol/L时,两者作用曲线趋势比较一致,都体现了类似的不稳定性.这可能是由于此时RL的浓度接近于临界胶束浓度[1].

图1 RL浓度对超精细分裂常数影响

RL浓度对ESR光谱峰值的影响如图2(B)所示.整体上看,峰值首先随着RL的升高而降低,然后升高.从图中可以看出,当浓度为临界胶束浓度时,峰值达到最高,此时样品能量最高.然而当RL浓度为0.08mmol/L时,光谱峰值突然大幅度降低,跟AN变化类似,这是由于体系此时的微极性降低,同时能量也有所降低.

图2 RL浓度对旋转相关时间的影响

表1 RL体系中微环境参数

RL体系中微环境参数如表1所示.从表中可以看出,当浓度小于临界胶束浓度时,3个峰的高度在一定范围内波动,当浓度在0.05~0.07mmol/L之间时,3个峰的高度均随着浓度升高而增大;当浓度为临界胶束浓度时,0和-1均达到最大值,+1接近峰值;当浓度大于临界胶束浓度时,随着浓度升高3个峰的高度均呈现出在一定范围上的减小.

2.2 不同含水量逆胶束ESR分析

RL逆胶束体系旋转相关时间随着含水量变化如图3(A)所示.整体趋势为先升高再降低.当水与正己烷的体积比为0.4%时,旋转相关时间最长,表明此时16-DSA分子运动受到的阻力最大[10].同时,在此时探针16-DSA分子与表面活性剂也产生一定的缔合作用[9].

而当水与正己烷的体积比从0.6%增加到1.0%时,旋转相关时间稍有下降趋势,表明体系的能量达到一个比较平衡的状态.并且随着含水量的增加,RL分子链变得疏松,即逆胶束个体变大,探针运动的范围有所增加.从实验结果来看,探针16-DSA在RL逆胶束体系中翻转运动受到的阻力较小,这可能是由于RL逆胶束中水核具有较强的超活性,使得探针在其中运动阻力非常小.

图3 含水量对旋转相关时间的影响

RL体系含水量对峰值的影响如图3(B)所示.由图中所示,随着含水量的增加,ESR峰值变化的规律性总体上是下降的.当含水量为0.4%时,ESR峰值达到最高.ESR峰值变化与旋转相关时间变化大体上较为一致.由于含水量增加,逆胶束水核变大,因此水核中结合水部分水层变厚,所以探针运动空间增大,受到的阻力减小,导致旋转相关时间降低,能量降低.

2.3 不同酶浓度ESR分析

实验中HRP在RL逆胶束水核中的浓度范围为0.1~0.5mmol/L,其浓度对旋转相关时间的影响如图4(A)所示.

不同HRP浓度对ESR峰值的影响如图4(B)所示.从图中来看,总体上峰值随HRP浓度的变化是先上升再下降的.当HRP浓度为0.1和0.2mmol/L时,ESR峰值均相对较低;当浓度升高至0.4mmol/L时,峰值明显的升高,而之后稍微有所下降.从结果中可以看出,ESR峰值变化与旋转相关时间随着HRP浓度的变化规律并不一致,这是由于ESR检测中各个参数的变化受很多因素的影响,各个参数之间有一定的联系但并不完全相互依赖.RL体系中当HRP浓度为0.4mmol/L时能量最大.

图4 HRP浓度对旋转相关时间的影响

当HRP浓度在0.1~0.3mmol/L之间时,旋转相关时间长短较为接近,分别为1.7127ns,1.7545ns和1.6955ns.而当HRP浓度继续升高,旋转相关时间有明显下降.说明此时探针分子运动受到的阻力突然降低,体系的微粘度降低.类似地,当HRP浓度为0.4和0.5mmol/L时,旋转相关时间也比较类似.在RL体系中,探针仍然处于水核中的结合水中,HRP集中在中心的自由水中[16-17].

2.4 探针定位分析

图5 探针与酶在逆胶束水核中分布情况

逆胶束水核中的水分为两类,第一类是自由水,分布在水核的中心部位;第二类为结合水,分布在水核外围,紧贴表面活性剂[16-17].由结果来看,HRP分子聚集在逆胶束的自由水中,而进入逆胶束水核的探针处于结合水中,探针与酶在逆胶束的分布情况如图5所示.当越来越多的HRP分子进入水核中心时,由于位于自由水中,HRP分子倾向于相互之间聚集,连接紧密,“团簇”在一起.因此对于位于结合水中的探针来说,受到更小的阻力,因此旋转相关时间在高浓度HRP时有所降低.

2.5 不同负载状态下逆胶束的ESR光谱分析

图6展示了RL逆胶束-酶ESR光谱、RL逆胶束-苯酚ESR光谱和RL逆胶束-酶-苯酚ESR光谱.不同体系光谱不同特征将对于逆胶束体系性能特性有重要指示作用.从图6中可以得知,RL逆胶束-酶的ESR光谱的信号强度最弱,而RL逆胶束-苯酚ESR光谱的信号强度最强,说明该体系中自由基数量最多,鼠李糖脂分子与苯酚分子之间发生碰撞频率较高.而RL逆胶束-酶-苯酚的光谱强度居中.

图6 不同负载的逆胶束ESR光谱

RL-H:RL逆胶束-HRP体系;RL-P:RL逆胶束-苯酚体系;RL-H-P:RL逆胶束-HRP-苯酚体系

3 结语

研究采用电子自旋共振ESR技术研究了鼠李糖脂RL逆胶束酶体系的性能.采用ESR光谱技术计算得出超精细分裂常数变化,RL在正己烷中的临界胶束浓度为0.07mmol/L.通过分析ESR光谱中旋转相关时间的变化,得出探针在逆胶束中运动受阻和翻转所需时间的情况.同时,ESR光谱的峰值体现了样品中自由基含量的多少.通过旋转相关时间的比较,推测出辣根过氧化物酶主要存在于逆胶束体系中的自由水中.通过对旋转相关时间和能量的对比,推测出在逆胶束体系中辣根过氧化酶的浓度为0.4mmol/L的酶活最高.通过对比逆胶束体系、逆胶束酶体系以及逆胶束酶-苯酚体系的ESR光谱,RL逆胶束-苯酚体系的自由基最多.通过研究对16-DSA对两个体系作用,推测出探针自由基团定位于逆胶束水核中,并且推断探针位于水核的边缘区域,即结合水水层.

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Study of enzyme-reverse micelle systembyelectron spin resonance.

PENG Xin*, XU Peng-fei, DU Hao, TANG Yu, YUAN Lu, MENG Yong

(National & Local Joint Engineering Laboratory for New Petro-chemical Materials and Fine Utilization of Resources; Key Laboratory of Chemical Biology and Traditional Chinese Medicine Research (Hunan Normal University), Ministry of Education; Key Laboratory of the Assembly and Application of Organic Functional Molecules of Hunan Province；College of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan Normal University, Changsha 410081, China)., 2019,39(2)：818~822

In this study, a reverse micelle system was constructed using rhamnolipid, and the properties of rhamnolipid reverse micelles and rhamnolipid reverse micelle enzyme system were studied by electron spin resonance (ESR) technique. ESR spectroscopy was used to calculate the performance. The ultrafine splitting constant in the reverse micelle system was obtained. The study showed that the criticality of rhamnolipid in n-hexane was 0.07mmol/L. By analyzing the change of rotation correlation time in ESR spectrum, the electron spin probe was explored. At the same time, the peak of the ESR spectrum reflects the amount of free radicals in the sample. By comparing the reverse micelle system, the reverse micelle enzyme system and the reverse micelle enzyme-phenol system ESR spectra showed that the rhamnolipid reversed micelle-phenol system had the most free radicals. By studying the effect of 16-nitroxyl radical stearic acid on two systems, it was speculated that the electron spin probe free radicals were localized. In the reverse micelle water core, and inferred that the electron spin probe was located in the edge region of the water core, that was, the water-water layer was combined. This study provided a solid theoretical basis for the application of the reverse micelle enzyme system.

rhamnolipid；reversed micelle；electron spin resonance；probe；16-nitroxyl radical stearic acid

X132

A

1000-6923(2019)02-0818-05

彭 馨(1987-),女,内蒙古乌海人,讲师,博士,主要从事资源循环方面研究.发表论文20余篇.

2018-07-06

国家自然科学基金资助项目(51608194);湖南师范大学化学生物学及中药分析教育部重点实验开放基金资助项目(KLCBTCMR18-12)

* 责任作者, 讲师, xinp@hunnu.edu.cn