王 喆，邹微微，章志国，纪冬梅，曹云霞

在辅助生殖过程中，影响妊娠结局的一个重要步骤是胚胎移植技术。随着囊胚培养以及囊胚玻璃化冻融技术在生殖医学领域中的广泛应用，目前新鲜周期移植取消率增加，全胚胎冷冻后的冻融胚胎移植比例明显增长[1]。已有研究[2]表明，全胚胎冷冻可以使卵巢过度刺激综合征高风险、内膜异常、孕激素过高及患有全身性疾病等不适合新鲜移植的患者将胚胎冷冻以后再移植。有研究[3]表明冻融胚胎移植后的临床妊娠结局相比于新鲜周期移植的妊娠结局更好。患者自身条件、胚胎发育天数与质量及移植技术等多方面因素是决定冻融囊胚是否可获得临床妊娠的关键因素。Kovalevsky et al[4]的研究认为第5日(D5)囊胚冻融移植后临床妊娠率、种植率和抱婴率显著高于第6日(D6)冻融囊胚，但Hiraoka et al[5]研究表明D5和D6囊胚冻融移植的临床结局并无明显差异。胚胎移植技术中包含很多影响因素，包括移植管类型、移植管血染程度、胚胎装载入移植管的方式等均会影响妊娠结局。所以辅助生殖助孕中的冻融囊胚移植需要大样本统计分析并建立标准化操作流程来最大程度的帮助患者提高临床妊娠结局。本研究回顾性的分析了行体外受精(invitrofertilisation,IVF)或卵胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)治疗后首次解冻移植的患者共1 032例，比较Cook移植管与Wallace移植管、D5冻融囊胚与D6冻融囊胚对妊娠结局的影响。

1 材料与方法

1.1病例资料收集2016年8月～2017年8月在安徽医科大学第一附属医院生殖医学中心首次接受冻融囊胚移植助孕治疗的不孕症患者为研究对象。纳入标准：① 年龄<40岁；② 首次进行解冻移植的D5或D6囊胚；③ 不孕原因为盆腔输卵管因素或男方因素；排除标准：① 遗传性及家族性病史；② 有习惯性流产史、不良妊娠史；③ 子宫生殖道畸形；④ 疤痕子宫(剖宫产、子宫肌瘤挖除史)；⑤ 卵巢功能减退、子宫内膜异位症。本研究为病例对照研究，获得安徽医科大学第一附属医院伦理委员会批准。

1.2囊胚培养患者采用的促排卵方案包括长方案、短方案、拮抗剂方案、微刺激方案等。绒毛膜促性腺激素(hCG)注射后34～36 h取卵，所获卵母细胞置于受精培养液中，男方手淫法或穿刺法取精，精液采用梯度离心法或上游法处理。取卵后3 h行体外受精或者卵胞浆内单精子显微注射。授精后4～6 h拆除颗粒细胞观察是否排出第二极体，再将受精卵移至卵裂期培养液，37 ℃培养箱中培养。授精后16～20 h观察原核形成情况，挑出多PN受精及受精异常胚胎，其余继续培养48 h，观察第3日胚胎，评估卵裂期胚胎质量，后将胚胎移入囊胚期培养液，继续培养至D5或D6囊胚。采用Gardner囊胚评分法对囊胚进行评分，将D5评分≥3AA、3AB、3BA、3BB或者D6评分≥4AA、4AB、4BA、4BB的囊胚定为优质囊胚。

1.3囊胚的玻璃化冷冻-解冻囊胚冷冻流程：① 采用Hamilton软件进行激光打孔，打孔时避开囊胚内细胞团；② 打孔后囊液流出约5 min后囊胚皱缩；③ 室温下，将囊胚移入平衡液中5 min；④ 囊胚转移至玻璃化冷冻液中不超过60 s；⑤ 将囊胚放至在已标记的冷冻载杆上并迅速浸入液氮中保存。囊胚解冻流程：① 将冷冻载杆浸入解冻液中不超过60 s；② 迅速将胚胎移至稀释液和洗涤液1、2中各3 min；③ 最后将胚胎转移至囊胚培养液中，并置于平板培养箱内37℃培养；④ 复苏2 h后观察囊胚的存活情况。

1.4囊胚移植本中心冻融周期首次解冻移植优先选择优质囊胚。

1.4.1移植前子宫内膜准备 囊胚移植的内膜准备分为自然周期和人工周期。采用自然周期的患者通过经阴道超声监测卵泡大小、内膜厚度和形态，通常于排卵日开始口服地屈孕酮(10 mg、Bid)，排卵后D5解冻移植D5或D6囊胚。采用人工周期的患者自月经第3日起口服戊酸雌二醇，12日后经阴道超声监测子宫内膜厚度，医师可根据内膜厚度调整用药剂量，待内膜厚度≥8 mm时，黄体酮60 mg/d肌注，5 d后解冻D5或D6囊胚并移植。

1.4.2移植管选择 Cook组采用美国Cook移植管(型号：K-JETS-551910-s)，由导引导管和转移导管组成：导引导管长17.3 cm，直径约1.81 mm，白色，头部成球颈型，头端预弯有25°倾角，宫颈塞设在离头端4 cm处，在离头端5 cm处另设有一个活塞；移植导管长24 cm，后端有金属支撑管支撑，前端为8 cm长的聚乙烯管，外径约0.93 mm，内径约0.47 mm，底部有间隔1 cm的4个刻度。在导引导管进入宫腔困难时，可加用支撑芯辅助导引导管穿越宫颈。Wallace组采用英国Wallace移植管(型号：1816)，长18 cm，由两部分组成：外导管为聚丙烯管，直径约2.24 mm，外导管内常规含有内芯，内导管为聚氨酯管，直径约1.65 mm。

1.4.3冻融囊胚移植方法 在实施胚胎移植前嘱患者憋尿，取截石位。行经腹部B超确定子宫位置、宫体与宫颈的角度、宫颈管长度及宫腔深度。插导引导管前去除宫颈粘液，用含囊胚培养液的棉签清洗宫颈内口。两组装载胚胎的方法相同，待移植医师提示可以装载胚胎时开始装载，移植管末端连接1 ml注射器，用囊胚培养液冲洗移植管，先抽吸约1 cm空气，其次是约2 cm含胚移植液，最后是约1 cm空气。装载完毕后将移植管递给助手辅助医师进行移植。Cook组移植流程：手术医师将导引导管由宫颈内口进入宫腔，如果由宫颈口进入宫腔困难，可在导引导管内插入支撑芯辅助穿越宫颈，然后将支撑芯抽出，由助手协助将装载胚胎的转移导管插入宫腔，缓慢推注完全后留管40 s，取出转移导管及导引导管，送培养室检查有无胚胎残留。Wallace组移植流程：将外导管由宫颈内口轻插入宫腔，插入外导管成功后，抽出内芯，由助手协助插入装载有胚胎的内导管，将胚胎缓慢注入宫腔后，留管40 s，将移植内、外管一起抽出，送培养室检查有无胚胎残留。

表1 Cook组与Wallace组的一般资料比较

1.5胚胎移植后处理及妊娠结局判断患者平卧休息40 min后离院，医生指导下继续予以黄体支持治疗。生化妊娠：移植后14 d测血hCG阳性；临床妊娠：移植后30 d行阴道B超检查宫腔内孕囊数目及有无心管搏动。临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植囊胚周期数×100%；胚胎种植率=B超下检测到孕囊数/移植囊胚数×100%；异位妊娠率=异位妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%；单卵双胎率=单卵双胎妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%。

2 结果

2.1患者基本情况分析共有1 032个周期符合本研究纳入标准，Cook组共627个周期，其中D5组472个周期，D6组155个周期；Wallace组共405个周期，其中D5组304个周期，D6组101个周期。各组患者的年龄、体质量指数(BMI)、基础卵泡刺激素(FSH)值、基础黄体生成素(LH)值、基础雌二醇(E2)等一般情况比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，组间有可比性。见表1。

2.2不同移植管对妊娠结局的影响Cook组与Wallace组、Cook-D5组与Wallace-D5组、Cook-D6组与Wallace-D6组各组间的获卵数、受精数、2PN数、囊胚形成率、移植胚胎数、移植日内膜厚度差异均无统计学意义(P>0.05)，Cook组的生化妊娠率、临床妊娠率、胚胎种植率均高于Wallace组，差异有统计学意义(P<0.05)，两者的异位妊娠率与单卵双胎率差异无统计学意义(P>0.05)，见表2；在同样移植D5冻融囊胚的情况下，Cook-D5组的生化妊娠率、临床妊娠率、胚胎种植率均高于Wallace-D5组，差异有统计学意义(P<0.05)，Cook-D5组(2.24%)的单卵双胎率虽明显高于Wallace-D5组(0.49%)，但单卵双胎率差异无统计学意义(P>0.05)，见表3；在同样移植D6冻融囊胚的情况下，Cook-D6组与Wallace-D6组的生化妊娠率、临床妊娠率、胚胎种植率差异均无统计学意义(P>0.05)，见表4。

2.3D5冻融囊胚和D6冻融囊胚的实验室及妊娠结局比较无论使用Cook移植管或者Wallace移植管，Cook-D5组、Wallace-D5组的获卵数、受精数、2PN数、囊胚形成率、生化妊娠率、临床妊娠率、胚胎种植率均分别高于Cook-D6组、Wallace-D6组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5、表6。

表2 Cook组与Wallace组的囊胚形成与妊娠结局比较

表3 Cook-D5组与Wallace-D5组的囊胚形成与妊娠结局比较

表4 Cook-D6组与Wallace-D6组的囊胚形成与妊娠结局比较

3 讨论

近年来研究表明冻融移植周期在辅助生殖技术中应用越来越广泛，可获得与新鲜移植周期相当甚至更好的妊娠结局。在冻融移植周期中，内膜准备方案、子宫内膜厚度、胚胎发育天数及质量、胚胎移植管的选择、胚胎装载技术、是否使用超声引导、移植难易程度、不同医师的熟练程度等多种因素均会影响胚胎是否移植成功。关于移植管是否会影响妊娠结局目前尚无定论[6-7]。有研究[8]表明D5新鲜囊胚移植的妊娠率和种植率高于D6新鲜囊胚移植, 但冻融囊胚移植周期中由于冷冻及复苏的影响，不同发育天数囊胚移植的选择目前仍存在争议。因此在冻融囊胚移植周期中，移植管的选择和囊胚发育天数的选择是目前临床上急待需要解决的问题。

表5 Cook-D5组与Cook-D6组的囊胚形成与妊娠结局比较

表6 Wallace-D5组与Wallace-D6组的囊胚形成与妊娠结局比较

3.1胚胎移植管的选择目前临床上的胚胎移植管主要分为软移植管和硬移植管，而已有较多研究证实软移植管比硬移植管的妊娠结局更优。但是不同软管间哪种移植管更好，目前的研究大部分为小样本对新鲜胚胎的研究，且并无统一结论。Cook移植管和Wallace移植管是目前生殖中心最常使用的两种移植管，而关于哪种移植管更好目前尚无统一意见。Saldeen et al[9]的一项前瞻性研究比较202名患者使用Cook Sydney IVF(K-JETS-7019-SIVF)移植管与198名患者使用Edward-Wallace移植管，发现两者的临床妊娠率与活产率差异无统计学意义。Rhodes et al[10]研究表明Cook World移植管相比Edward-Wallace移植管，临床妊娠率高5%，但两者差异无统计学意义。

本研究共纳入1 032例解冻移植周期，比较两种软移植管对妊娠结局的影响。两组患者在平均年龄、基础性激素、取卵周期获卵数、受精数、2PN数、囊胚形成率、移植胚胎评价和内膜厚度等基本参数上具有可比性，分析了移植管这一因素对妊娠结局的影响，结果表明Cook移植管可将首次冻融周期的临床妊娠率与胚胎种植率提高将近7%，尤其对于移植D5冻融囊胚Cook移植管相比于Wallace移植管的优势更显著，临床妊娠率提高将近8%，可以显著改善妊娠结局，而移植D6冻融囊胚虽Cook移植管妊娠结局更好，但两者差异无统计学意义，该结果对临床有指导意义。Cook移植管获得了较好的临床结局可能和以下因素有关：一是为了方便手术医师更准确快速的将移植管置管入宫腔，Cook移植管在设计时考虑到女性宫体与宫颈的生理弯曲度，将导引导管前端预先保留25°倾角；宫颈塞的刻度设在离头端4 cm处且前端头部圆钝，确保导引导管进入宫颈内口后立即停止，尽可能减少导引导管进入宫腔的深度，避免导引导管对宫腔的损伤。二是移植导管内径更细，仅为1.4Fr(约0.47 mm),且柔软，可避免造成宫内出血以及内膜损伤，但同时是否因内径过细造成单卵双胎率增加仍需增大样本量进一步探究；装载胚胎的液体量有可能影响妊娠结局，在装载胚胎时管径越细，所需的含胚液体量越少，虽同样装载约2 cm含胚液体，Cook移植导管所用的液体量较Wallace内管少，且Wallace移植管没有刻度，无法精确把握移植管的空气与液体量；三是Cook导引导管无内芯，相对于有内芯的Wallace导管更加柔软，且置管后不用拔出内芯可避免对宫腔产生抽吸作用导致子宫内膜损伤。四是相对于Wallace移植管内管与外管之间空隙较大，Cook导引导管与移植导管之间贴合更为紧密，降低了胚胎滞留于移植管内的概率。而移植D6囊胚Cook移植管相比Wallace移植管优势不明显，其原因可能是：D6囊胚较D5囊胚囊胚腔扩张更大且可能已孵出，在冻融过程中对胚胎质量影响更大；Wallace移植管较Cook移植管管径大，若囊胚已孵出，则在囊胚被装入移植管的过程中，孵出囊胚在管径较大的移植管内其形态保持更完好，受到的摩擦力更小，其内细胞团所受的影响也越小。

3.2冻融移植囊胚的选择已有研究[11]表明囊胚发育天数、冻融囊胚质量以及移植数目显著影响冻融囊胚的妊娠结局。谭巧 等[12]回顾性的分析了1 539例D5与D6冻融囊胚移植妊娠结局, 结果显示对于35周岁以下的女性，移植D5或者D6优质囊胚其临床妊娠结局无统计学差异，而在无优质冻融囊胚移植情况下，移植D5非优质冻融囊胚可获得较好的妊娠结局。本研究结果显示，D5冻融囊胚组获卵数、2PN数、受精数、囊胚形成率、生化妊娠率、临床妊娠率和胚胎种植率均高于D6冻融囊胚组。可能原因如下：D6囊胚较D5囊胚囊胚腔扩张更大，行玻璃化冷冻操作后可能对囊胚质量影响更大；随着培养时间的延长，培养环境及培养液的改变可能导致胚胎质量变差；D6囊胚发育较D5囊胚相对迟缓，D5囊胚较D6囊胚DNA损伤可能更少；还有研究[13]显示胞质内线粒体含量明显影响胚胎发育潜能，D5囊胚线粒体含量可能高于D6；D6冻融囊胚移植与子宫内膜准备不同步也可能影响妊娠结局。

综上所述，在移植D5优质冻融囊胚时，优先选择Cook-K-JETS-551910-S移植管较Wallace-1816移植管进行移植可获得更好的临床妊娠率和胚胎种植率；在D5与D6同是优质囊胚的情况下，优先选择D5囊胚进行移植可获得更好的临床妊娠率与胚胎种植率。胚胎移植过程中选择适合患者的移植管可直接影响手术操作及妊娠结局。应尽量选择软质、管径较细、符合生理构造、顺滑和对子宫内膜损伤最小的胚胎移植管，以减少困难移植发生率，减轻患者焦虑情绪，提高临床妊娠结局。本研究为回顾性数据分析，仅纳入了本中心常使用的两种类型移植管，对于应该选择何种移植管以期获得最大的临床妊娠率，仍需要进行多中心的、纳入更多移植管类型的前瞻性研究。