王良芳，陈志武

缺血性损伤脑血管疾病是全球性的重大公共卫生问题，研究脑缺血损伤的机制一直是临床和基础研究较为关注的课题之一。内皮源性硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)和一氧化氮(nitric oxide, NO)均可由脑血管内皮细胞产生和释放并参与缺血性脑损伤过程[1-3]。有研究[4-5]表明缺血性脑损伤可激活RhoA-ROCK(Ras homolog gene family, member A/Rho associated coiled coil-forming kinase)通路，并且内皮源性NO可抑制RhoA-ROCK通路的活性，但迄今尚不清楚缺血性脑损伤中，内皮源性H2S、NO及RhoA-ROCK通路三者中，孰是最先改变的原发因素以及内皮源性H2S是否也可抑制RhoA-ROCK通路的活性。因此，该文观察了大鼠脑血管内皮细胞中内皮源性H2S、NO及RhoA-ROCK通路三者在低氧性损伤中的动态变化，并探讨了内皮源性H2S对RhoA-ROCK通路活性的影响。

1 材料与方法

1.1主要试剂DMEM培养基、内皮细胞生长添加剂、胶原酶Ⅱ购自美国Sigma公司； CCK-8试剂盒、NO检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；RhoA活性测定试剂盒购自美国骨架细胞公司；胎牛血清、RIPA裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司；小鼠抗β-actin多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Anti-Von Willebrand Factor antibody、兔抗ROCK1和ROCK2抗体、eNOS抗体、CSE抗体购自美国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1大鼠脑血管内皮细胞原代培养实验动物 SD大鼠，雌雄各半，200～300 g，饲养温度在(22±2)℃，通风良好，可自由摄水进食。取大鼠5只，10%水合氯醛麻醉后置75%乙醇浸泡3 min。将大鼠置无菌操作台上，心脏灌流无菌PBS，直至肝脏和舌头发白。无菌状态下迅速断头取脑，显微镜下小心剥离脑血管后转移至超净台中预先加有胶原酶Ⅱ(工作浓度为2 mg/ml)的EP管中，用眼科镊将脑血管反复剪碎后37 ℃水浴消化30 min，之后离心弃上清液，加入含内皮细胞生长添加剂和20%新生牛血清的DMEM培养液重悬后接种于培养皿，CO2恒温恒湿孵育箱内培养，24 h后换液去除未贴壁和坏死细胞，之后视细胞生长状态换液；待80%细胞融合时，选取生长状态良好的细胞进行传代，之后按要求分组实验。

1.2.2免疫荧光染色检测培养细胞vWF表达 倒置显微镜下进行细胞形态学观察；vWF免疫荧光标记染色：取第二代状态良好的内皮细胞，胰酶消化后接种于放有载玻片的培养皿中；待细胞爬满载玻片 80%时，吸弃细胞培养液；用预冷PBS清洗3次，加入预冷的4%多聚甲醛4 ℃固定30 min；PBS 清洗3次，0.1% Triton-100室温处理10 min; PBS清洗3次，加入封闭液室温孵育1 h; 加入羊抗大鼠vWF多克隆抗体(1 ∶100) 4 ℃过夜；次日PBS清洗后，加入荧光二抗室温孵育 1 h；PBS 清洗3次，加入DAPI染色5 min，荧光封片剂封片后激光共聚焦显微镜下观察细胞染色情况并拍照。

1.2.3低氧模型制备 低氧24 h前培养基换成厌氧培养基，将细胞置于37 ℃、N295%、CO25%的可控厌氧室中。

1.2.4CCK-8法检测细胞活力 培养瓶中细胞长满后，经胰酶消化离心重悬后制成单细胞悬液，10% FBS培养液调节细胞浓度为8×104/ml，每孔100 μl接种于5块96孔板，每板设置空白对照，每组设5个复孔培养，待细胞80%融合，吸弃培养液，PBS清洗2次，加无血清培养液培养24 h后放入N295%、CO25%厌氧培养箱，分别在1、2、4、8、24 h各取出1块，并取出相应的空白对照板；向每孔加入10 μl CCK-8溶液，震荡混匀后室温下孵育1～3 h，酶标仪于450 nm波长处读取吸光度(optical density，OD)值。细胞活力(%)=(加药细胞OD-空白OD)/(对照细胞OD-空白OD)×100%。

1.2.5亚硝酸还原法检测NO含量 细胞培养液中NO代谢产物NO3在硝酸还原酶的作用下生成NO2，NO2酸性条件下与α-萘胺及对-氨基苯磺酸生成红色偶氮化合物。按说明书要求将试剂和待测样品分别加入各管后静置10 min，双蒸水调零，酶标仪于波长550 nm处测各管OD值。

1.2.6亚甲基蓝分光光度法测定H2S含量 醋酸锌可以吸收硫化氢生成硫化锌沉淀，酸性条件下硫离子可与三氯化铁 (FeCl3)和N,N-二甲基-对苯二胺硫酸盐(NDPA)反应，室温下生成稳定的亚甲基蓝，在波长670 nm处测其OD，根据标准曲线计算出H2S的浓度。

1.2.7G-LISA检测RhoA活性 按实验要求分组，待大鼠脑血管内皮细胞长满约80%后，置于冰上加冰冷裂解液提取蛋白；用蛋白质测定试剂测定蛋白质浓度，平衡各样本浓度；蛋白质提取物转移到Rho-GTP-结合蛋白预包被的平板上；400 r/min的振荡器上4 ℃孵育30 min，洗涤液常温洗2次，每次甩干；加RhoA一抗，400 r/min的振荡器上室温孵育45 min，洗涤液常温洗2次，每次甩干；加二抗振荡器400 r/min室温孵育45 min，洗涤液常温洗2次，每次甩干；每孔加HRP AB液室温下15 min后，加入HRP终止缓冲液；酶标仪在波长490 nm处读取OD值。

1.2.8Western blot检测不同低氧时间胱硫醚γ-裂解酶(CSE)、内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)、Rho激酶ROCK1和ROCK2蛋白含量变化 分别于规定的低氧时间收集相应细胞，加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取蛋白。用BCA试剂盒测定总蛋白含量，各组取30 μg等量蛋白煮沸变性，行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，封闭后加入兔抗鼠ROCK、eNOS、CSE多克隆抗体一抗(1 ∶1 000)孵育；4 ℃过夜，次日洗膜后加入二抗室温孵育1 h，洗膜后加入显色液显影曝光内皮细胞L显色，Image J定量分析灰度值。

1.3统计学处理采用SPSS 16.0软件进行分析。两组之间独立样本进行t检验，多组之间单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1原代培养内皮细胞鉴定光镜下原代培养的内皮细胞为梭形或多边形，旋涡状生长，呈聚集状，贴壁牢固(图1A)。免疫荧光染色显示：细胞核DAPI染色为蓝色荧光，超过90%的细胞胞质存在红色荧光，说明内皮细胞纯度达90%(图1B)。

图1 原代培养的大鼠脑血管内皮细胞和免疫荧光鉴定

2.2不同低氧时间对大鼠脑血管内皮细胞活力的影响与control组比较，低氧时间延长细胞活力明显下降。低氧8 h细胞活力下降了(39.3±4.3)%，低氧24 h后细胞活力下降(60.9±6.1)%，差异均有统计学意义，表明低氧可致大鼠脑血管内皮细胞活力下降。见图2。

2.3大鼠脑血管内皮细胞低氧后NO、H2S含量及RhoA活性的动态变化大鼠脑血管内皮细胞低氧1、2、4、8、24 h后分别检测H2S、NO含量及RhoA活性变化，与control组比较，低氧1 h后H2S含量显著下降(F=4.23，P<0.01)；NO含量在低氧4 h后才开始显著下降(F=3.19，P<0.05)；RhoA活性低氧8 h后显著增加(F=7.31，P<0.01)。上述三者变化差距随时间延长而显著加大。见图3。因此定量结果表明在大鼠脑血管内皮细胞低氧中，H2S降低最早，NO次之，RhoA活性增加再次之。

图2 不同低氧时间对大鼠脑血管细胞活力的影响

与control组比较：*P<0.05，**P<0.01

2.4低氧不同时间对大鼠脑血管内皮细胞CSE、eNOS、ROCK1和ROCK2蛋白表达的影响Western blot结果显示：CSE和eNOS蛋白随低氧时间延长呈持续下降趋势，低氧4 h时CSE蛋白表达较正常组有了显著下降；低氧8 h后eNOS蛋白才开始明显降低；相反ROCK1、ROCK2蛋白表达随低氧时间延长呈上升趋势，低氧8 h时ROCK1、ROCK2蛋白表达显著增加。见图4。上述各蛋白的变化随低氧时间延长而显著加大。

2.5H2S对大鼠脑血管内皮细胞中RhoA活性的影响

2.5.1内源性H2S对RhoA活性的影响 与control组比较，RhoA特异性抑制剂C3转移酶(C3 Transferase,C3 TF)(25 μg/ ml，8 h)可显著抑制RhoA活性，差异有统计学意义(P<0.05)，但CSE抑制剂DL-炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine,PPG)(10 mmol/L，4 h)可显著加RhoA活性，差异有统计学意义(P<0.05)，提示内源性H2S可抑制RhoA的激活。见图5。

2.5.2内源性和外源性H2S对C3转移酶诱导的RhoA活性降低的影响 与C3TF组比较，PPG组(10 mmol/L，4 h)可显著抑制C3TF诱导的RhoA活性降低，差异有统计学意义(P<0.05)，提示内源性H2S均可增强C3TF诱导的RhoA活性降低。H2S供体NaHS(50 μmol/L、30 min)可直接增强C3TF诱导的RhoA活性降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。

图3 大鼠脑血管内皮细胞低氧H2S、NO的含量和RhoA活性的动态变化(n=3)

A：H2S含量动态变化；B：NO含量动态变化；C：RhoA活性动态变化；与 control组比较：*P<0.05,**P<0.01

2.5.3外源性H2S对RhoA活性的影响 外源性H2S供体硫氢化钠(sodium hydrosulfide,NaHS)10、50和100 μmol/L处理30 min，与control组比较差异有统计学意义,可明显并呈一定的浓度依赖性地降低RhoA活性，提示外源性H2S也可抑制RhoA的激活。见图6。

图4低氧不同时间诱导大鼠脑血管内皮细胞损伤后CSE、eNOS、ROCK1、ROCK2蛋白表达的影响(n=3)

A：CSE表达水平；B：eNOS表达水平；C：ROCK1/2表达水平；与control组比较：*P<0.05，**P<0.01

图5 PPG对大鼠脑血管内皮细胞中RhoA活性的影响(n=3)

与control组比较：*P<0.05；与C3 TF组比较：#P<0.05

图6 NaHS对大鼠脑血管内皮细胞中RhoA活性的影响(n=3)

与control组比较：*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

小G蛋白的Rho家族包括RhoA、Rac1和Cdc42[6-7]，其中RhoA是最具特色的蛋白质，它作为分子开关在无活性的GDP结合和活性GTP结构之间循环，与下游靶点相互作用以引发各种细胞反应。研究[8]表明，RhoA-ROCK通路与心血管疾病发病机制有关，如冠状动脉粥样硬化性心脏病、高血压、心力衰竭等，其抑制剂法舒地尔(fasudil)可以治疗许多心血管疾病。

缺血性脑损伤是一严重危害人类健康的脑血管疾病，脑血管内皮与缺血性脑损伤的发生密切相关。内皮源性NO和H2S是调节脑血管内皮舒张功能的两种重要的血管内皮舒张因子，其改变参与了脑缺血损伤过程。在急性脑缺血动物模型中，有研究[9]显示脑缺血可激活ROCK，而ROCK抑制剂fasudi或Y-27632可抑制ROCK的激活，并减少脑梗死面积。因此，RhoA-ROCK通路的激活也是脑缺血损伤过程中的一个因素。本研究表明在大鼠脑血管内皮细胞低氧损伤过程中，内皮源性H2S和内皮源性NO分别在低氧1 h和4 h时发生了明显降低，而RhoA-ROCK通路活性在8 h时才有明显增加。并且Western blot检测结果也表明内皮源性H2S合成酶CSE和内皮源性合酶eNOS蛋白表达的降低及ROCK蛋白表达的增高分别发生在大鼠脑血管内皮细胞低氧的4 h、8 h和8 h时，也支持着内皮源性H2S降低发生最早。上述的实验结果还表明内皮源性H2S在低氧1 h时就明显降低了，但其合成酶CSE蛋白表达在4 h时才显著降低，提示在大鼠脑血管内皮细胞低氧过程中，H2S合成酶CSE的活性也有显著降低，并且早于其蛋白表达的下降。因此，本研究结果表明在大鼠脑血管内皮细胞低氧损伤过程中，内皮源性H2S降低发生最早，其次为NO，而RhoA-ROCK通路的激活迟于前二者。

在低氧损伤过程中，大鼠脑血管内皮中RhoA-ROCK通路改变迟于NO和H2S的降低，但前者的改变是否由NO和H2S降低引起的呢？有研究[10]表明NO可阻止RhoA从细胞质转位到细胞膜上，从而抑制RhoA的活化。本研究表明内源性H2S和外源性H2S均可抑制RhoA的激活。并且内源性和外源性H2S均可增强C3 TF诱导的RhoA活性降低，也支持着H2S可抑制RhoA的激活。因此，结合前述的内皮源性H2S降低发生在前，RhoA-ROCK通路激活发生在后，可以认为在低氧损伤过程中，大鼠脑血管内皮细胞中RhoA-ROCK通路的激活可能是继发于H2S的降低。至于内皮源性H2S与NO的相互作用已有大量文献报道，此处不再赘述了。

综上所述，在大鼠脑血管内皮细胞低氧损伤过程中，内皮源性H2S降低发生最早，其次为NO，而RhoA-ROCK通路激活发生在后，可能是继发于H2S的降低。