郭有新，陈宝刚，刘建伟，李 立，张 红，马志红

喉癌(laryngeal carcinoma, LC)作为常见的头颈部恶性肿瘤，其主要病理类型为鳞状细胞癌，目前认为其发病与吸烟、饮酒、环境因素、放射线、病毒感染及微量元素的缺乏相关[1-2]。根据我国2015年全国肿瘤登记中心(NCCR)最新公布的中国癌症统计数据显示：2015年新发恶性肿瘤约429万例，死亡人数约281万；其中喉癌新发病例约2.64万，死亡人数约1.45万例[3]，严重威胁人类的生命与健康。miRNA作为一类高度保守的非编码单链小RNA，已证实其通过转录后调控参与影响几乎所有的生理、病理进程，在多个物种中发挥重要作用[4-5]。不少miRNA被发现在喉癌发生过程中发挥着促进或者抑制的调节功能[6-7]，但大部分miRNA在喉癌转移过程中的调控机制目前尚不明确。该研究探讨miR-133b对喉癌细胞增殖、凋亡、侵袭的影响及机制。

1 材料与方法

1.1细胞及主要试剂总RNA抽提试剂TRIzol购自美国Invitrogen公司；hsa-miR-133b mimics/NC、转染试剂riboFECTTM CP Reagent、hsa-miR-133b real-time PCR引物购自广州市锐博生物科技有限公司；逆转录试剂盒Reverse Transcription System、SYBR®PrimeScriptTMRT-PCR Kit试剂盒、mRNA SYBR Green荧光定量PCR试剂购自日本TaKaRa公司；Propidium Iodide/碘化丙啶、RNase A、MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；喉癌Hep-2细胞购自北京协和基础研究所细胞中心。

1.2方法

1.2.1胃癌差异表达miRNA筛选 本研究基于GEO数据库下载并获取喉癌组织miRNA芯片高通量数据集GSE47610(GSM1153144- GSM1153148)，其中包括3例喉癌组织样本与2例正常喉组织。本研究主要采用的生物信息学分析工具为Qlucore Omics Explorer (QOE)3.2，由瑞典隆德大学研制，一种新型的生物信息学分析软件，可用于分析基因芯片、基因表达、实时PCR以及DNA甲基化等多种生物学数据。

1.2.2实时定量PCR检测喉癌组织miR-133b表达量 选取河北省承德市医学院第二附属医院2015年6月～2017年6月收治的46例喉癌患者为研究对象，手术切除的喉癌组织标本为喉癌组，远离肿瘤的正常喉组织标本为对照组。TRIzol法提取组织总RNA，取10 μl RNA进行逆转录，采用U6作为内参进行相对定量分析，定量反应体系按照12.5 μl SYBR Premix Ex Taq，1 μl PCR Forward Primer, 1 μl Uni-miR qPCR Primer，2 μl cDNA模板，8.5 μl ddH2O，总体积为25 μl，每个样品设置3个平行孔。扩增程序为：预变性95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、20 s，40个循环；采用2-ΔΔCt法计算miR-133b的相对表达量。

1.2.3转染hsa-miR-133b至Hep-2细胞及转染效率检测 培养并接种1×105个Hep-2细胞至含有适量完全培养基的24孔培养板中，使转染时的细胞密度达到30%～50%。用 30 μl 1× riboFECTTMCP Buffer稀释1.25 μl 20 μmol/L hsa-miR-133b mimic，轻轻混匀。加入3 μl riboFECTTM转染试剂，轻轻吹打混匀，室温孵育15 min。将培养板置于 37 ℃的CO2培养箱中培养24 h。荧光显微镜检测转染效率。其中，转染hsa-miR-133b NC设为对照组。

1.2.4MTT法检测细胞增殖 将过表达miR-133b组及NC组Hep-2细胞稳定培养后传代于96孔板，完全培养基培养，分别于24、36、48、72 h进行MTT检测。每组4个重复。96孔板每孔加入20 μl MTT (5 mg/ml PBS溶解)，孵育4 h然后弃除上清液。每孔里面再加入150 μl Formazan溶解液，振荡10 min，充分溶解结晶物。酶标仪(490 nm)测定光吸收值。

1.2.5流式检测细胞周期 将过表达miR-133b组及NC组Hep-2细胞稳定培养后传代，完全培养基培养至24 h，用胰酶消化收集细胞，加入1 ml 75%预冷乙醇中，吹打均匀，4 ℃固定12 h以上，再加入PBS洗涤，离心1 000 r/min，5 min，清洗两次。重悬细胞用0.5 ml PBS，每孔加入PI和 RNaseA至终浓度50 μg/ml，37 ℃温浴30 min。流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.6流式检测细胞凋亡 悬浮两组细胞离心(2 000 r/min离心5 min)收集，贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集，用PBS洗涤细胞两次(2 000 r/min离心5 min)收集5×105细胞，，加入500 μl的缓冲液悬浮细胞，加入5 μl Annexin V-EGFP混匀后，加入5 μl碘化丙啶，混匀，室温避光反应15 min，用流式细胞仪进行检测。

1.2.7细胞侵袭实验 将冻存于-80 ℃冰箱的BD matrigel 4 ℃过夜(24 h)，变成液态，取300 μl无血清培养基，加入60 μl Matrigel，混匀，加入上室各100 μl，放入37 ℃培养箱中，孵育4～5 h，此间经常观察，当出现“白色层”时，说明已经变为固态。用无血清培养基洗Matrigel 1次，每孔加入100 μl两组细胞悬液，下腔室中加入500 μl含有20%FBS条件培养基，37 ℃培养箱中孵育24 h，取出Transwell用PBS洗2遍，5%戊二醛固定(4 ℃)，加入结晶紫(0.1%)染色10 min，室温0.5 h，PBS洗2次，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察。

1.2.8双荧光素酶载体法验证miR-133b靶基因 通过双荧光素酶报告基因检测系统，分别构建带有野生型和突变型GSTP1-3’UTR的报告载体pLUC；将hsa-miR-133b mimic、NC分别与pLUC- GSTP1-Mut、pLUC- GSTP1-WT共转染到293T细胞中，测定萤火虫荧光素酶相对活性。

1.2.9Western blot检测GSTP1蛋白 将过表达miR-133b组及NC组Hep-2细胞稳定培养后传代，完全培养基培养至24 h，提取两组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，沸水变性，配制10%的分离胶及5%的浓缩胶，SDS-PAGE电泳；转膜后，加入用封闭液稀释的相应一抗，室温摇床孵育2 h，并用TBS洗膜3次，每次15 min；再加入用封闭液稀释的相应二抗室温摇床孵育1 h，并用TBS洗膜3次，每次15 min；ECL显色检测。

2 结果

2.1喉癌表达miRNAs的筛选基于GEO获取的喉癌组织miRNA芯片高通量数据，根据设定的数值过滤标准和中位值标准化处理，对表达差异miRNAs进行分层聚类分析，获得5个表达上调miRNA，8个表达下调miRNA，见图1。通过数据分析及前期实验室研究成果，选择miR-133b进行功能研究。

2.2miR-133b在喉癌中差异表达及临床特征关系采用Real-time PCR法检测miR-133b在23例喉癌组织和对应23例癌旁正常喉黏膜组织的表达，结果表明喉癌组织标本中miR-133b表达显著下调约4.1倍，差异有统计学意义(P<0.0001)，见图2。此外，针对23例喉癌组织临床特征分析，表明miR-133b的表达水平与肿瘤局部浸润深度、是否存在区域淋巴结转移、患者临床分期以及组织学分级呈负相关，不同期别之间的差异有统计学意义，见表1。以上结果提示miR-133在喉癌的发生发展中可能具有关键的生物学作用。

图1 喉癌表达miRNAs的筛选

图2 hsa-miR-133b在喉癌组织中差异表达

2.3过表达miR-133b抑制喉癌细胞的增殖采用带有Cy3荧光蛋白的hsa-miR-133b mimic转染喉癌Hep-2细胞24 h后，荧光显微镜观察大致转染效率超过80%，见图3A。同时，Real-time PCR法检测miR-133b表达情况，结果表明相对于对照组，转染组miR-133b表达升高至30倍(P<0.0001)，见图3B，表明转染成功。MTT法检测过表达miR-133b喉癌Hep-2细胞增殖情况，结果显示随着培养时间增加至72 h，miR-133b表现出显著性抑制喉癌增殖效果，尤其在48 h和72 h，抑制率达到(29.32±2.04)%和(34.81±2.76)%，见图3C。

表1 miR-133b表达与喉癌患者临床特征的关系

图3 过表达miR-133b抑制喉癌细胞的增殖

A：荧光显微镜观察采用带有Cy3荧光蛋白的hsa-miR-133b mimic转染效率；B：Real-time PCR法检测转染hsa-miR-133b 24 h后miR-133b表达情况；C：MTT法检测过表达miR-133b、NC喉癌Hep-2细胞增殖；与NC组比较：****P<0.000 1

2.4过表达miR-133b影响喉癌细胞周期通过流式技术PI单染法检测过表达miR-133b组及NC组细胞周期，结果显示相对于对照组，miR-133b过表达组S期细胞数量明显增多，说明细胞发生S阻滞，DNA合成受阻，细胞生长停滞，数量减少，见图4。

图4 过表达miR-133b影响喉癌细胞周期A:NC组;B:hsa-miR-133b mimic组

2.5过表达miR-133b促进喉癌细胞凋亡通过流式技术检测过表达miR-133b组及NC组细胞凋亡，结果显示对照组细胞凋亡率为(6.82±0.65)%，miR-133b过表达组凋亡率为(16.47±1.92)%，表明过表达miR-133b促进喉癌Hep-2细胞凋亡，差异有统计学意义(P=0.001 2)，见图5。

2.6过表达miR-133b抑制喉癌细胞侵袭通过Transwell小室侵袭实验来检测细胞的侵袭转移能力，结果显示对照组细胞侵袭数目为(452±36)，miR-133b过表达组细胞侵袭数目为(116±13)，表明过表达miR-133b显著抑制喉癌Hep-2细胞侵袭，差异有统计学意义(P=0.000 1)，见图6。

2.7miR-133b靶基因GSTP1的预测与验证使用TargetScan数据库对miR-32进行靶基因预测，从预测结果中挑选GSTP1等候选基因进行实验。通过双荧光素酶报告基因检测系统，分别构建带有野生型和突变型GSTP1-3’UTR的报告载体pLUC；将hsa-miR-133b mimic及NC分别与pLUC-GSTP1-Mut、pLUC-GSTP1-WT共转染到293T细胞中，通过测定萤火虫荧光素酶相对活性，结果表明hsa-miR-133b可以显著降低pLUC-GSTP1-WT中hRluc表达(P=0.043)，并且针对pLUC-GSTP1-Mut没有作用，见图7。说明miR-133b可以通过GSTP1-3’UTR结合位点调控hRluc的表达，进而表明其存在靶向调控的关系。

图5 过表达miR-133b促进喉癌细胞凋亡A:NC组;B:hsa-miR-133b mimic组

图6 过表达miR-133b抑制喉癌细胞迁移 ×200A:NC组;B:hsa-miR-133b mimic组

2.8过表达miR-133b降低靶基因GSTP1表达Western blot检测过表达miR-133b组及NC组GSTP1蛋白表达，结果显示过表达hsa-miR-133b可以明显下调GSTP1蛋白表达量(P=0.013)，见图8。

图7miR-133b靶基因GSTP1的预测与双荧光素酶报告基因验证

与NC组比较：*P<0.05

图8 过表达miR-133b降低靶基因GSTP1表达与NC组比较：*P<0.05

3 讨论

随着以miRNA为代表非编码RNA在肿瘤领域研究的不断深入，越来越多的喉癌相关miRNA被发现深度参与其发生发展治疗过程中。Shen et al[8]用亚硫酸氢盐测序技术针对104个喉癌组织及对应癌旁组织进行miR-34a启动子区域CpG6位点DNA甲基化水平测序，结果表明喉癌组织中miR-34a启动子甲基化程度显著高于对照组，此外，通过Kaplan-Meier存活曲线分析表明miR-34a启动子高甲基化与总生存率差相关(Log-Rank检验，P<0.05)。Liu et al[9]研究发现miRNA-125a在喉癌组织和喉癌干细胞Hep-2-CSCs中低表达，且miRNA-125a可以通过靶向调控造血细胞特异性相关X-1逆转喉癌干细胞的顺铂抗性，过表达miRNA-125a后，发现细胞对多柔比星、依托泊苷、长春新碱的耐药性大大提升。Zhou et al[10]研究表明miR-632在喉癌组织和喉癌细胞系中均表现为明显上调表达，且其促进细胞增殖和克隆形成，促进细胞迁移和侵袭，增强细胞增殖相关蛋白、cyclinD1和c-myc表达，且Pearson相关分析显示miR-632表达与喉癌组织中GSK3 mRNA表达呈负相关。这些异常表达miRNA发挥喉癌癌基因或抑癌基因作用，有望作为喉癌的早期诊断的新标志物，某些miRNA更有望可以作为喉癌的新治疗靶点。

本研究前期基于GEO获取的喉癌组织miRNA芯片高通量数据，分析差异表达miRNA并选择miR-133b进行功能研究。首先，收集喉癌组织样本，检测表明喉癌中miR-133b表达显著下调约4.1倍，且miR-133b的表达水平与肿瘤局部浸润深度、是否存在区域淋巴结转移、患者临床分期以及组织学分级呈负相关，提示miR-133b在喉癌的发生发展中可能具有关键的生物学作用。其次，转染hsa-miR-133b mimic转染喉癌Hep-2细胞，实现细胞水平过表达miR-133b。本研究通过细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、细胞侵袭等实验表明过表达miR-133b可以显著抑制喉癌细胞的增殖、影响喉癌细胞周期、促进喉癌细胞凋亡以及抑制喉癌细胞迁移，提示miR-133b在喉癌发展中扮演了抑癌基因的角色。最后，考虑到miRNA作为一种内源性非编码RNA，其发挥功能方式主要通过完全或者部分互补结合靶基因3’非翻译区影响靶mRNA稳定性，甚至降解mRNA，从而实现转录后水平调节靶基因的表达。通过生物信息学预测，笔者发现GSTP1是miR-133b潜在靶基因之一，通过双荧光素酶报告基因实验明确其之间确实存在关系，且过表达hsa-miR-133b可以明显下调GSTP1蛋白表达量，意味着miR-133b可能是通过调控GSTP1来发挥其在喉癌中的作用。

谷胱甘肽转移酶Pl(glutathione S-transferase pi, GSTP1)，基因定位于染色体的1lql3，该基因全长约3 bp，包括6个内含子和7个外显子，编码210个氨基酸，属于谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases, GSTs)。GSTs能催化谷胱甘肽与亲电子物质发生反应，对芳香族化合物具有较高降解性[11]。诸多研究[12]表明GSTP1在预防肿瘤发生的过程中起重要作用，但同时也是肿瘤细胞对化疗药物耐受的原因，并与许多耐药相关基因在肿瘤中共表达。在膀胱癌研究中，唐荣金 等[13]通过慢病毒表达系统，建立稳定低表达GSTPl基因的膀胱癌细胞T24细胞株，发现GSTPl表达下调抑制T24细胞增殖，并其机制可能与促进T24细胞凋亡相关。在喉癌研究中，周建荣[14]通过建立人喉鳞癌组织及其癌旁正常黏膜组织的双向凝胶电泳图谱，识别鉴定其差异表达的蛋白质，结果表明GSTP1在喉癌中表达上调，这与本研究中miR-133b在喉癌中表达下调，且通过靶向结合GSTP1发挥作用一致。近年来发现GSTP1多态性与肿瘤的易感性关系密切，有研究通过meta分析GSTP1基因启动子区甲基化检测在前列腺癌临床诊断中的意义，发现前列腺癌GSTP1基因启动子区相比正常对照组呈现显著高甲基化，差异有统计学意义(OR=17.98, 95%CI:12.16～26.58,P<0.000 1)，不同亚组间差异无统计学意义[15]。Matthias et al[16]发现GSTP1基因型频率在喉癌与对照中的分布情况差异有统计学意义，该基因多态性可能与喉癌的遗传易感性存在关联。

综上所述，本研究表明miR-133b通过GSTP1对喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡、侵袭行为的影响及其对肿瘤局部浸润深度、是否存在区域淋巴结转移、患者临床分期以及组织学分级呈负相关等临床意义，为将来基于miR-133b进行喉癌临床诊断、预后判断及分子靶向治疗提供新的思路和理论依据。