超声波辅助对乳化交联工艺制备丝素蛋白微球形貌的影响

2019-02-21王宗乾王邓峰

纺织学报 2019年2期

王宗乾，王邓峰，周杭，李俊

(1.安徽工程大学纺织服装学院，安徽芜湖 241000；2.安徽工程大学安徽省纺织印染行业技术中心，安徽芜湖 241000)

丝素是蚕丝的主体成分，其质量约占蚕丝总质量的70%～80%[1]，作为一种天然蛋白质资源，具有良好的生物相容性和生物降解性能[2]，因此丝素蛋白在生物医药、组织工程等领域的应用受到了较多关注。同时，基于丝素蛋白的结构与反应特性，可将其设计加工制备薄膜[3]、凝胶[4]、多孔材料、纳米纤维、微球等不同形貌的产品[5-7]，具有丰富的可改造空间。应用于生物医药领域的微球通常是以高分子材料为载体，包裹或吸附药物而制成的微小球状实体，粒径范围分布在1～300 μm区间[8]。有研究表明，微球粒径是衡量其效能的重要指标，随着粒径的减小，微球的比表面积增加，有助于提升微球表面的吸附量，提高光散射比率等[9]；微球粒径减小也将导致分布在微球表面的相对原子数增多，致使微球表面能增加[10]；同时基于凝胶粒子体积改变的弛豫时间与其半径的平方成正比理论，粒径越小的微球对外界刺激的反应速度更快[11]。丝素蛋白微球应用于生物医药领域具有药物缓释作用，在慢性病治疗、创伤修复等领域具有广阔的应用前景[12]。综上，微球的制备是开发和利用丝素蛋白微球的首要环节，微球粒径的分布将直接影响其性能。潘岳林等[13]采用自组装方法制备了丝素蛋白微球，研究发现随着丝素蛋白质量分数的增加，微球粒径增大，微球也将发生集聚。杨道伟[14]以乳化交联工艺制备了丝素蛋白空白微球，并对影响微球粒径的工艺因素进行探讨。王鼎等[15]以自组装方法制备了丝素蛋白微球，并以此为模板制备介孔二氧化硅(SiO2)空心微球，在其研究中发现，不同体积比制备的丝素蛋白微球出现粘黏现象。

众所周知，超声波具有声空化效应，已广泛应用于化学化工、生物医药、纺织印染等领域[16-18]。当前已有学者将超声波技术应用于微球结构的调控：郭生伟等[19]利用超声辐照引发包覆乳液聚合制备了聚丙烯酸正丁酯(PBA)空心微球，透射电镜(TEM)和动态光散射(DLS)测试结果显示，空心微球粒径均一，壳层厚度均匀；汪衍涛等[20]以电火花-超声复合加工法制备镍微球，结果表明加入超声波之后，小粒径(0～10 μm)镍微球比例明显升高，且小粒径微球比例随着超声波频率的增大而降低，随着超声波功率的增大而升高；王伟华等[21]以异丙氧基钛(TITP)为原料，利用超声波辅助溶胶/凝胶法制备微米级多孔性二氧化钛微球，结果表明超声波辅助可减小微球粒径，进一步提高微球比表面积。综上所述，超声波辅助工艺有助于降低微球的平均粒径并有利于微球的均匀分布。

已有文献同时表明，不同的脱胶、溶解等工艺对丝素蛋白结构与性能产生显著影响，其中尿素脱胶工艺、氯化钙/乙醇/水三元体系溶解对丝素蛋白结构的影响较弱，可提取低损伤的丝素蛋白[22-23]。以尿素脱胶工艺提取的丝素蛋白为原料，采用乳化交联工艺制备丝素蛋白微球极易发生黏连团聚现象，微球粒径分布不匀。目前还没有超声波辅助乳化交联工艺制备丝素蛋白微球的报道。本文采用尿素脱胶、溶解等工艺制备了丝素蛋白，并结合电泳图谱分析其分子量分布；基于乳化交联工艺制备了丝素蛋白微球，并对其粒径、形貌进行表征；在此基础上，设计了超声波辅助乳化交联工艺制备微球的方案，采用激光粒度分析仪、扫描电镜(SEM)分别对超声辅助前后制备微球的粒度分布和形貌特征进行测试与表征，并通过超声频率和功率的调节，探讨了超声波辅助对乳化交联工艺制备丝素蛋白空白微球粒径分布、形貌的影响规律，以期为微球粒径的调控及均匀丝素蛋白微球的制备提供实验基础。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

蚕生丝(安徽青阳县三方丝绸有限公司)；尿素(南京化学试剂有限公司)；无水乙醇(上海泰坦科技股份有限公司)；异丙醇、石油醚、非离子表面活性剂Span 80、无水氯化钙、50%戊二醛、液状石蜡、聚合度为20 000聚乙二醇(上海阿拉丁试剂有限公司)。以上试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1丝素蛋白的制备

蚕生丝经脱胶、溶解、透析、浓缩等工序后，制得了实验所需的丝素蛋白液。具体操作如下：精确称取一定质量的蚕丝并按1∶30的浴比将其浸渍于8 mol/L的尿素溶液中，在100 ℃下脱胶3 h，取出并经去离子水冲洗至无滑腻感，于40 ℃烘箱内烘至质量恒定制得尿素脱胶蚕丝；取2 g脱胶蚕丝按1∶20的浴比浸渍于预先配制的CaCl2/C2H5OH/H2O三元溶剂(三组分的量比为1∶2∶8)中，在50 ℃下先溶胀2 h，后升温至85 ℃，恒温振荡溶解2 h，得到丝素蛋白溶解液；丝素蛋白溶解液经离心(转速 6 000 r/min，时长10 min)处理，将上层清液注入透析袋(截留分子质量8 000～14 000 kDa)中进行透析，透析持续3 d，每间隔4～6 h换水；经聚乙二醇浓缩制得质量分数为4%的丝素蛋白液，备用。

1.2.2微球乳化交联制备工艺

量取40 mL液状石蜡与4 mL的Span 80搅拌混合40 min，用移液枪缓慢滴加4%的丝素蛋白溶液3.6 mL，在400 r/min条件下继续搅拌40 min形成均匀稳定的油包水(W/O)型乳液后，缓慢滴加50%戊二醛1.2 mL，持续搅拌3 h，低速离心，倒出上层清液，用石油醚、异丙醇多次洗涤，干燥，收集微球。

1.2.3超声波辅助微球制备

在乳化交联工艺制备微球的乳化阶段加以超声波辅助，施加的超声波频率在28、45、80 kHz 3档可调，功率可在40、60、80、100 W 4档可调，超声波作用时间均为5 min，温度为室温；超声波辅助工艺中，微球制备的乳化时长缩短至5 min。

1.3 测试方法

1.3.1蚕丝脱胶率

采用称重法计算蚕丝脱胶率。具体操作如下：脱胶前后蚕丝样品于40 ℃ 烘箱调查间距干至质量恒定，后放入干燥器中平衡24 h，精确称量，并按下式计算脱胶率。

式中:R为脱胶率，%；m1为脱胶前蚕丝质量，g；m2为脱胶后蚕丝质量，g。

1.3.2丝素蛋白分子质量分布

采用SDS-PAGE凝胶电泳方法测试本实验制备丝素蛋白的分子质量分布；具体操作同文献[22]所述。

1.3.3微球粒径分布

采用Nano ZS90纳米激光粒度仪(英国Malvern公司)对制备微球的粒径分布进行分析，测试前将各微球样品分散于超纯水，粒径测试区间设定为0.02～2 000 μm。

1.3.4微球形貌观察

用吸管吸取少量干燥微球平铺于附有导电胶的载物台上，表面喷金，将丝素蛋白微球置于电镜台，采用S-4800扫描电子显微镜(日本Hitachi公司)检测微球表面形貌。

2 结果与讨论

2.1 尿素脱胶蚕丝及丝素蛋白性能

采用相同的尿素脱胶工艺，平行对5组蚕生丝进行脱胶处理，测试脱胶率数据在27.56%～28.36%之间，平均值为27.87%，标准偏差值为0.30。该脱胶率值稍低于传统的碳酸钠脱胶数据，但与文献所述不同工艺脱胶数据基本吻合[24]，同时27.87%的脱胶率值也与丝胶在蚕丝中的质量分布相对应[1]；尿素脱胶机制在于对丝胶组分的吸湿溶胀，促进丝胶蛋白的溶解，尿素脱胶体系不呈碱性，对丝素蛋白结构与分子量不产生影响，这也是尿素脱胶工艺制备低损伤丝素的缘由。此外，在尿素脱胶平行实验中，脱胶率标准偏差值小，表明不同批次之间在脱胶率上不存在显著差异，该工艺稳定且易于控制。尿素脱胶蚕丝保留了原有的蚕丝光泽，其蓝光白度值大于70%，该数值高于传统碳酸钠脱胶所得蚕丝的白度值(68.43%)[22]，这可能与丝素蛋白在碱性环境中易于发生光氧化黄变及蛋白质变性相关。

尿素脱胶蚕丝经溶解、离心、透析处理，制得丝素蛋白液，实验对其进行了SDS-PAGE凝胶电泳分析，结果如图1所示。

图1 丝素蛋白分子质量分布Fig.1 Molecular weight distribution of silk fibroin.(a) Original image; (b) Schematic diagram

脱胶蚕丝可由CaCl2/C2H5OH/H2O三元体系完全溶解，得到淡黄色溶液，离心后底部有痕量的黑色物质，判断为氯化钙药剂所含杂质；经透析后，丝素蛋白液呈半透明乳白色，没有丝素蛋白析出及团聚现象。由图1可知，制备的丝素蛋白集中分布在40～100 kDa区间，此外在稍低于31.0 kDa以及稍高于14.4 kDa处也有分布，这与丝素蛋白由轻链和重链2种蛋白构成密切相关。由此可见尿素脱胶没有致使重链丝素蛋白水解，保留了丝素蛋白原有的分子量分布。文献研究表明，分子量较大的丝素蛋白更易成膜成球，且成膜结构较为稳定，具有更好的耐热和机械稳定性能，有助于提升微球的稳定性能[25]；在微球制备与应用中，微球形貌的稳定性至关重要，为此尿素脱胶为获取大分子的丝素蛋白提供了有效途径。

2.2 乳化交联工艺制备的空白微球

图2示出乳化交联工艺制备微球的粒径分布。由图可知，微球粒径集中分布于10～20 μm区间，平均粒径为15.48 μm，微球粒径分布的标准偏差值为0.515。采用SEM对微球形貌进行表征，如图3所示。发现微球呈现了较为严重的集聚和粘连形貌，形成了多个较大尺寸的微球集聚体，这和微球粒径分布测试数据并不相符。分析致使微球集聚和黏联的原因在于乳化交联工艺中，因大分子的丝素蛋白具有较强的自聚集效应，且极易成膜[25]，在乳化交联工艺的机械搅拌条件下，大分子丝素蛋白分散不均匀，致使形成的单个微球形貌并不完整，即丝素蛋白在单个微球上并未形成完整且稳定的球壁，在烘干过程中，微球球壁相互之间重新发生黏结，并形成较大的聚集体。在粒径分布的测试中，需要将微球分散在水介质中，且介质中蛋白微球的质量浓度很低(小于0.01%)，微球之间碰撞接触的机会较小，难以形成集聚体，因此仅凭微球粒径测试数据尚不能全面反映制备微球的真实形貌。为解决这一问题，必须在乳化交联制备微球的工艺中，促使丝素蛋白均匀分散，并保证微球形貌的完整，避免干燥过程中球壁丝素蛋白发生再次聚集。

图2 空白微球粒径分布图Fig.2 Particle size distribution of blank microspheres

图3 空白微球形貌Fig.3 Morphology of blank microspheres.(a) Microsphere aggregation(×500); (b) Amplification of microsphere aggregation(×1 000)

2.3 超声辅助制备的空白微球

2.3.1超声频率的影响

在恒定的超声功率(40 W)下，改变超声频率，测试了不同频率作用下制备微球的粒径分布与形貌特征，结果分别如表1和图4所示。

表1 超声频率对微球粒径分布的影响Tab.1 Impact of ultrasonic frequency on size distribution of blank microspheres

注：*指测试微球样品中，具有平均粒径的体积百分比。

图4 超声频率对微球形貌的影响(×500)Fig.4 Impact of ultrasonic frequency on morphology of microspheres(×500)

由表1可知：随着超声频率的增加，微球平均粒径明显减小，与未经超声波辅助的乳化交联工艺制备微球相比，在超声频率为80 kHz时，微球粒径几乎减小至原来的1/5；同时，超声波辅助下具有平均粒径的微球体积百分比值逐渐增加，微球粒径分布标准偏差SD值逐渐减小，2个指标的变化也表明了超声波辅助还有助于微球粒径的集中分布，提高粒径的均匀程度。

由图4可知，超声波辅助后制备微球形貌完整，微球间未发生黏连与聚集，且微球粒径随着超声频率的增加逐渐减小。超声波辅助工艺下，因声空化效应，丝素蛋白大分子在乳化交联体系中被均匀分散，依靠氢键和范氏力发生的蛋白大分子集聚现象被打破，分子之间无法产生自聚集和自组装，因此成球后球壁状态完整，微球个体稳定。随着超声频率的增加，超声化效应增强，丝素蛋白的分散倾向于更小且更加均匀[26]，为此随着超声频率的增加，制备微球的粒径逐渐减少，且粒径分布更加集中。但在实验过程中发现，超声波辅助对微球产率产生较大影响，随着超声频率的增加，制备微球的产率逐渐降低，当频率达到80 kHz，微球产率已降低至乳化交联工艺的40%～50%，而当超声频率为45 kHz，成球率也有所降低，但降低幅度在10%之内。综上，实验选择在45 kHz条件下，继续探讨超声功率对微球粒径分布和形貌的影响规律。

2.3.2超声功率的影响

在恒定的超声频率(45 kHz)条件下，分析了不同功率的超声波作用对制备微球粒径分布与形貌特征影响的规律，结果分别如表2、图5所示。

表2 超声功率对微球粒径分布的影响Tab.2 Impact of ultrasonic power size distribution of blank microspheres

图5 超声功率对微球形貌的影响Fig.5 Impact of ultrasonic power on morphology of microspheres

由表2可知，随着超声波功率的增加，制备微球的平均粒径也呈逐渐减小的趋势，但减小幅度不及表1中超声频率的影响；与未经超声波辅助的乳化交联工艺相比，在45 kHz，100 W条件下制备微球粒径(4.07 μm)减少至原微球粒径(15.48 μm)的26%；此外，由微球体积百分比和粒径分布的SD数据可知，超声波功率的增加有助于提高微球粒径分布的均匀性。

由图5可知，在恒定的超声波频率作用下，增加超声功率将进一步减少微球粒径，且制备微球未出现集聚和粘连现象。随着功率的增加，镶嵌于微球之间小微球或小颗粒有增加的趋势，这表明随着超声波辅助效应的增强，声空化效应将直接作用于丝素蛋白内部氢键及肽键，促使丝素蛋白分解成小分子量的蛋白，甚至在乳化过程中形成微小乳滴，难以成球，因此造成微球收率降低。综上，超声波辅助乳化交联工艺可显著改善微球的团聚现象，促进微球粒径的均匀分布，但也有降低微球收率的不利影响，在微球制备中尚需对超声波辅助工艺进行优化设计。