洪松彬 ，何石兰 ，黄海潮 ，聂 阳

（1.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405； 2.广东省中医院二沙岛分院，广东 广州 510105；3.广东食品药品职业学院，广东 广州 510520）

红 景 天 Rhodiola crenulata（Hook.f.et Thoms.） H.Ohba为蔷薇目景天科多年生植物，其根茎粗壮且略带芳香，是主要入药部位[1]，具有扶正固本、理气养血的功效，主治气虚血瘀、气短乏力、倦怠气喘等气虚证。现代药理学研究表明，其具有改善心肺功能、促进血管生长、保护缺氧心肌、改善急性脑梗死状态等作用[2-4]。黄酮类化合物是红景天中主要活性成分之一，包括山柰酚、草质素苷、槲皮素、花色苷等[5]。黄酮类化合物一般以水溶性苷或脂溶性苷元2种形式存在，由于苷与苷元的极性相差较大，传统提取方法如水煎煮法、回流法、酶解法、超声法和微波法均难以同时提高两类成分的提取率[6]。表面活性剂提取是近年兴起的中药提取法，利用其增溶作用，可增加药材中苷元等脂溶性成分的溶解度，从而大大提高低极性成分的提取率[7]。本试验中采用表面活性剂-超声协同提取法，通过正交试验优选红景天总黄酮的提取工艺参数，为在工业化生产中引进高效、经济的中药提取方法提供参考。

1 仪器与试药

仪器：UV-1800型紫外分光光度计（日本岛津公司）；SB-5200DTD型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；D101型大孔树脂（天津波鸿树脂科技有限公司）。

试药：芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，批号为100080-201708，纯度≥99%）；红景天饮片（广东康美药业股份有限公司，批号为180120361）；试验所用试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 药材处理流程及提取方法

红景天清洗→干燥→粉碎→过80目筛→密封保存→称取适量红景天粉末（5 g）→加入乙醇和1.0%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液→超声提取→回收溶剂浓缩粗提物→抽滤去除药材碎渣→大孔树脂柱纯化→微孔滤膜滤过不溶性颗粒→取上清液（即为供试品溶液）→检测。

2.2 红景天总黄酮的相关测定

测定波长选择：以芦丁为对照品，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法测定总黄酮含量。称取芦丁对照品10.80 mg，精密称定，以70%乙醇溶解并定容至50 mL，摇匀，得质量浓度为0.216 g／L的对照品溶液。分别吸取对照品溶液和2.1项下供试品溶液适量，各置25 mL容量瓶中，加入5%NaNO2溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，加 10%Al（NO3）3溶液 1.0 mL，摇匀，放置 6 min，加入4%NaOH溶液 10.0 mL，用70%乙醇定容，摇匀，放置15 min。以70%乙醇为参比液，在300～700 nm波长区间扫描。结果对照品溶液和供试品溶液在510 nm波长处均有最大吸收，故选取510 nm为测定波长。

提取率计算：准确量取芦丁对照品溶液 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，分别置 25 mL 容量瓶中，于510 nm 波长处测定吸光度。以质量浓度（X，μg／mL）为横坐标、吸光度（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程 Y＝0.012 4 X＋0.003 57，r＝0.999 4(n＝7)。结果表明，芦丁质量浓度在 5.417 ～55.282 μg／mL 范围内与吸光度线性关系良好。精密度和24 h稳定性试验结果的 RSD 分别为 1.10% 和 0.92% （n＝6）；加样回收率为 98.58% ，RSD ＝1.50%(n＝6）。取供试品溶液适量，依法操作，测定510 nm波长处吸光度，计算总黄酮质量浓度，并按公式计算提取率。提取率（%）＝[K×cx× V／（106× m）]×100% ，式中，K 为稀释倍数，cx为供试品溶液中总黄酮质量浓度（μg／mL），V为供试品溶液体积（mL），m 为红景天饮片质量（g）。

2.3 表面活性剂筛选

称取6份药材样品粗粉各5.00 g，置烧瓶中，加10倍量70%乙醇，分别加入体积分数为1.0%的不同亲水疏水平衡值（HLB）的表面活性剂，超声（功率为500 W）提取1 h，滤过后得供试品溶液。按2.2项下方法测定吸光度，计算总黄酮提取率，结果见表1。阴离子表面活性剂的加入可显著提高总黄酮的提取率，其中以SDS效果最好，可能是SDS形成的胶束更有利于黄酮的增溶[8]。故选用SDS作为表面活性剂。

2.4 单因素试验

称取6份药材样品粉末各5.00 g，试验条件为按料液比1∶10(g∶L)加入70%乙醇作为溶剂，加入SDS至终体积分数为1%，超声提取15 min。

SDS浓度选择：分别加入SDS至终体积分数依次为0.5% ，1.0% ，1.5% ，2.0% ，2.5% ，3.0% ，平行提取 3次，按2.2项下方法测定总黄酮含量并计算其提取率，结果见图1。可见，随着SDS体积分数的增加，总黄酮提取率也逐渐升高，在SDS体积分数为1.5% 时，总黄酮提取率最大，再增加SDS体积分数，总黄酮提取率不再升高，故SDS的体积分数应在1% ～2%范围进行优化。

超声功率筛选：将超声功率分别设为 300，400，500，600，700，800 W，平行提取 3 次。按 2.2 项下方法测定总黄酮含量并计算其提取率，结果见图2。可见，超声功率在300～600 W范围内总黄酮提取率逐渐升高，当功率超过700 W后，总黄酮提取率显著降低。其原因为超声功率过大时，高频振动产生的热效应使温度升高，导致热稳定性较差的黄酮类成分含量减少，故应在500～700 W范围内对超声功率进行优化。

提取时间筛选：分别超声提取 5，10，15，20，25，30 min，平行提取3次，按2.2项下方法测定总黄酮含量并计算其提取率，结果见图3。可见，随超声时间的延长，总黄酮提取率逐渐升高，在15～20 min时总黄酮提取率最高，继续延长时间，总黄酮提取率反而降低。这可能是因超声波具有较强的热效应，过长时间作用会破坏黄酮类成分，故应在15～25 min范围内对提取时间进行优化。

表1 表面活性剂种类对总黄酮提取率的影响

图1 SDS体积分数对总黄酮提取率的影响

图2 超声功率对总黄酮提取率的影响

图3 超声时间对总黄酮提取率的影响

乙醇体积分数筛选：分别以体积分数为40%，50%，60%，70%，80%，90%的乙醇作为溶剂进行提取，平行提取3次，按2.2项下方法测定总黄酮含量并计算其提取率，结果见图4。可见，随着乙醇体积分数的增加，总黄酮提取率逐渐升高，当乙醇体积分数为60%时总黄酮提取效率最高，而乙醇体积分数大于70%时总黄酮提取率开始下降。这是因黄酮大多以苷的形式存在于药材中，其水溶性较好，当乙醇和水达到适合的比例时，糖苷与苷元两者均能更好地溶剂化，若乙醇体积分数过高则不利于黄酮苷类成分的溶解。此外，从实际生产成本方面考虑，需节约乙醇的用量，故乙醇体积分数应在40%～60%范围内进行优化。

图4 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响

料液比筛选：分别按料液比 1∶5、1∶10、1∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30(g∶L)的比例加入溶剂进行提取，平行提取3次，按2.2项下方法测定总黄酮含量并计算其提取率，结果见图5。可见，溶剂比例逐渐增大，总黄酮的提取率逐渐升高，但当料液比超过1∶15(g∶L)后，再增加溶剂的用量时总黄酮提取率并无明显提高，反而延长了溶剂回收、产物浓缩干燥等后续步骤的耗时，故对料液比应在 1∶10～1∶20(g∶L)范围内进行优化。

图5 料液比对总黄酮提取率的影响

2.5 正交试验

直观分析和极差分析：根据单因素试验，对提取总黄酮所需的SDS体积分数（A）、超声功率（B）、提取时间（C）、乙醇体积分数（D）、料液比（E）5 个因素进行 3 水平的正交试验 L27（35）分析。结果见表2和表3。得出的最佳提取条件为 A2B2C1D3E1，即 SDS终体积分数为1.5%，超声功率为 600 W，提取15 min，乙醇体积分数为60%，料液比为1∶15(g∶L)。极差分析结果显示，各因素对总黄酮提取率的影响强度依次为A＞B＞D＞E＞C。

表2 正交试验因素水平表

表3 L27(35)正交试验设计与结果

方差分析：为了区分因素水平和试验误差引起的数据波动，需在直观分析和极差分析基础上进行方差分析[9]。计算各因素的平均方差，其中因素C平均方差值最小，故将因素C选为误差项。方差分析结果表明，A，B，D 3个因素对总黄酮提取率的影响差异均有统计学意义（P＜0.05），而C和E两因素对总黄酮提取率的影响差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表4。

表4 方差分析结果

2.6 验证试验

称取 5份药材样品，每份各 5.00 g，按 2.5项下最佳提取条件进行操作，按2.2项下方法测定总黄酮含量并计算其提取率。结果提取率分别为4.03%，4.02%，4.05% ，4.03% ，4.06% ，平均 4.04% ，RSD 为 0.81%(n＝5)，表明优化的提取工艺稳定可靠，提取率较高。

3 讨论

L27（35）正交试验分析结果表明，表面活性剂体积分数、超声功率和乙醇体积分数为显著影响总黄酮提取率的主要因素。在表面活性剂的选择上，本试验中分别考察了离子型和非离子型2种HLB值大于13.0的表面活性剂对总黄酮提取率的影响。可见，使用离子型表面活性剂的提取率明显高于非离子型表面活性剂。黄酮类化合物结构上含有多个酚羟基而带有酸性，在一定pH范围内带电，因此可通过静电力与带有电荷的离子型表面活性相互亲合，从而加强SDS等表面活性剂的增溶作用，提高总黄酮提取率[10]。表面活性剂可通过形成胶束结构来增加溶质的水溶性，临界胶束浓度（CMC）是衡量表面活性剂增溶能力的关键指标，溶剂中CMC值越小，增溶能力越强。由表面活性剂的筛选结果可推测，在60% 乙醇中，SDS的CMC值最小。单因素试验结果表明，当SDS体积分数达2.0%后，即使继续增加，总黄酮的提取率也不再增加，这是由于SDS体积分数超过CMC后，继续增加SDS的剂量，形成胶束数量并未随之增加，故未能提高总黄酮提取率。此外，过多使用SDS，可导致药材中其他成分的溶解度增加，从而引入其他杂质。

超声提取法是目前广泛用于中药成分提取的方法之一，利用超声波的高频机械振荡作用使溶剂快速进入植物细胞中，同时通过空化效应瞬间将植物组织和细胞分解、破裂，使细胞的内容物释放与溶出，且超声波具有热效应，可增大细胞内溶质的溶解度或扩散速率，3种作用机制相互配合发挥作用，可大大提高中药成分的提取率[11]。本试验结果表明，超声功率是影响黄酮提取率的次要因素，超声功率的设定必须适中，功率偏低，提取率不高，而功率过高，产生的热效应过大，会导致稳定性较差的黄酮类成分氧化或分解[12]，正交试验分析显示功率设为600 W为最佳。

黄酮类化合物的提取主要以乙醇为溶剂，90%～95%乙醇适用于苷元的提取，60%乙醇适用于黄酮苷的提取，将优化工艺的验证结果和乙醇体积分数单因素提取结果进行对比分析，可见在同样以60%乙醇作为提取溶剂的条件下，前者的提取率明显高于后者，原因是适量的SDS作为增溶剂能有效增加黄酮苷元在60%乙醇中的溶解度，从而显著提高总黄酮提取率，同时也可减少乙醇的用量，降低生产成本。

超声提取时间和料液比在5个因素中对总黄酮提取率的影响较小，但两提取因素的设定仍值得注意，提取时间过长，超声热效应可产生过多的热量，会导致黄酮分子中具有还原性的酚羟基发生氧化[13]；溶剂用量过多，会增加溶剂回收、提取物浓缩、产物干燥等后续步骤的时间消耗，导致生产效率降低，成本耗费增加。综合本试验各方面数据分析，利用表面活性剂-超声协同提取红景天总黄酮，按料液比1∶15(g∶L)加入60%乙醇作为溶剂，以终体积分数1.5%的SDS为增溶剂，超声（功率设为600 W）提取15 min，可获得满意的总黄酮提取率。