钟文雨 ，于士龙 ，汪 宇

（1.沈阳药科大学，辽宁 沈阳 110042； 2.中国人民解放军北部战区空军医院，辽宁 沈阳 110042）

芪桑口服液在中国人民解放军北部战区空军医院临床应用已近10年，疗效确切，主要用于治疗皮肤瘙痒、慢性荨麻疹、神经性皮炎、鼻炎、哮喘等症，为该院治疗过敏性鼻炎的主要用药。该制剂主要由黄芪、黄芩、陈皮、麻黄、当归、细辛、桑葚等14味中药组方，其现行标准仅对黄芩进行了定性鉴别，未对其主要成分进行含量测定。为进一步控制该制剂的质量，保证临床用药安全有效，本研究中采用薄层色谱（TLC）法对黄芪、陈皮、麻黄进行定性鉴别，采用高效液相色谱（HPLC）法测定黄芩苷含量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪，包括二极管阵列检测器，Chemstation工作站（美国 Agilent公司）；MS105DU型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；JA5003型电子分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；KQ3200DB型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

芪桑口服液（中国人民解放军北部战区空军医院，批号分别为 20151012，20151116，20151207，规格为每支 10 mL）；黄芩苷对照品（批号为 110715-201318，纯度为 98.5%），黄芪对照药材（批号为 121054-201115），陈皮对照药材（批号为 120908-201216），麻黄对照药材（批号为120915-201214），均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、磷酸为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 TLC 鉴别

黄芪[1-2]：取样品 80 mL，加热浓缩至 10 mL，加水10 mL，用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次20 mL，取上层液，分别用1%氢氧化钠溶液和正丁醇饱和水溶液各洗涤3次，每次20 mL，弃去洗涤液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪对照药材2 g，加水20 mL，煎煮1 h，滤过，滤液同法制成对照药材溶液。按芪桑口服液处方和工艺制备缺黄芪的阴性样品，同法制成阴性对照品溶液。按2015年版《中国药典（四部）》通则0502 TLC法(以下简称“药典TLC法”)试验，吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷 -甲醇 -水（13∶5∶2，V／V／V）10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1 A。

陈皮[3-4]：取样品20 mL，用乙酸乙酯振摇提取3次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取陈皮对照药材2 g，加水20 mL，煎煮1 h，滤过，滤液同法制成对照药材溶液。按芪桑口服液处方和工艺制备缺陈皮的阴性样品，同法制成阴性对照品溶液。按“药典TLC法”试验，吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯 -乙酸乙酯（3∶2，V／V）为展开剂，展开，取出，晾干，用同一展开剂二次展开，取出，晾干。置紫外光（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1 B。

麻黄[5-6]：取样品 40 mL，加热浓缩至 10 mL，加水10 mL，再加浓氨试液2 mL，用二氯甲烷振摇提取2次，每次30 mL，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取麻黄对照药材2 g，加水20 mL，煎煮1 h，滤过，滤液同法制成对照药材溶液。按芪桑口服液处方和工艺制备缺麻黄的阴性样品，同法制成阴性对照品溶液。按“药典TLC法”试验，吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯 -丁酮 -甲酸 -水（5∶3∶0.5∶0.5，V／V／V／V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铁溶液，日光灯下检视。结果供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。详见图1 C。

2.2 黄芩苷含量测定

2.2.1 色谱条件[7-9]

色谱柱：Diamonsil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 -0.4% 磷酸溶液（47 ∶53，V／V）；流速：1.0 mL ／min；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2.2.2 溶液制备

对照品溶液：取黄芩苷对照品约25 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，摇匀，即得。

供试品溶液：取样品20 mL，离心，精密量取上清液1 mL置50 mL容量瓶中，加50%甲醇稀释并定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：按芪桑口服液处方和工艺制备缺黄芩的阴性样品，同法制备阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2.2项下各溶液适量，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图(见图2)。结果阴性对照品溶液在与黄芩苷对照品溶液相同保留时间处无干扰峰，表明专属性良好。

线性关系考察：称取黄芩苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成黄芩苷质量浓度为200 μg／mL的对照品贮备液。分别精密量取上述贮备液并加50%甲醇稀释，制成质量浓度为 10，20，50，100，200 μg ／mL 的系列对照品溶液，各吸取20 μL，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。以黄芩苷质量浓度（X，μg／mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y＝82.965 X-414.53，R2＝0.999 8(n＝5)。结果表明，黄芩苷质量浓度在10～200 μg／mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取 2.2.2 项下对照品溶液 20 μL，按拟订色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果的RSD为0.08%（n＝6），表明仪器精密度良好。

图1 薄层色谱图

图2 高效液相色谱图

稳定性试验：取2.2.2项下供试品溶液适量，分别于室温下放置 0，2，6，12，24 h时按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。结果的 RSD为0.39%（n＝5）；表明供试品溶液在室温放置24 h内基本稳定。

加样回收试验：取已知含量（40.18 μg ／mL）的样品1.5 mL，共 6 份，分别加入黄芩苷对照品溶液（50 μg ／mL）1 mL，加50%甲醇定容至10 mL，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积并计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n＝6）

2.2.4 样品含量测定

取3批样品各适量，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样，平行测定3次，记录峰面积并计算样品含量。结果批号为 20151012，20151116，20151207的样品中黄芩苷含量分别为 2.009，2.016，2.014 mg ／mL。结合药材来源，以及药品生产、贮藏等因素，暂定每毫升样品含黄芩苷不得少于2.009 mg。

3 讨论

本制剂原质量标准较简单，仅有黄芩的定性鉴别，不仅鉴别数量过少，且未做包含阴性对照的方法学验证试验。本研究中参考相关文献和大量试验研究对原TLC法进行了验证和修订，解决了阴性干扰问题，并保证了试验的重复性。此外，研究中还另建立了陈皮的TLC法，其重复性及专属性均较好。

黄芩是芪桑口服液的君药之一，且处方量最大，具有较好的免疫抑制作用，尤其对Ⅰ型变态反应作用显著。黄芩的这种抗炎、抗过敏作用与芪桑口服液的抗过敏、抗支气管痉挛和抗组胺等功能主治一致。故本研究中选择黄芩苷作为芪桑口服液的定量指标。

预试验中对流动相体系进行了考察，分别采用了甲醇 -0.4% 磷酸溶液（28 ∶72，V／V）、甲醇 -0.4%磷酸溶液（40∶60，V／V）、甲醇 -0.4%磷酸溶液（47 ∶53，V／V）、甲醇 -0.4% 磷酸溶液（60 ∶40，V／V），结果发现，以甲醇 -0.4% 磷酸溶液（47 ∶53，V／V）为流动相时峰形和分离度均良好，故本研究中以此为流动相。

综上所述，本研究中建立的方法操作简便，专属性强，精密度、稳定性、重复性均较好，可用于芪桑口服液的质量控制。