杨会，曾红霞，张娜，任俭，汤谧，李煜华，陈伟，熊建顺，孙玉宏

（武汉市农业科学院，430345）

叶片是植物进行光合作用、呼吸作用及蒸腾作用的主要场所和重要器官，直接影响糖分的积累，其与植株生长势、营养供应、产量、品质、抗性等密切相关[1～3]，且叶片的形态结构在植物逆境胁迫应答中具有重要作用。高等植物成熟叶片是由叶原基顶端分生组织周围区起始，在一系列基因精确调控下，建立近-远轴（离植物茎秆较近的一面为近轴，离植物茎秆较远的一面为远轴）、基-顶轴（叶片基部叶柄到叶片的尖端）和中-侧轴极性（叶脉中轴指向叶片边缘的结构），朝着特定的方向分裂和分化而形成。叶片发育过程除受遗传因子调控外，还受光照、温度和水分等外部环境因素的影响[4，5]。植物叶片形状多样化，但无论是单叶还是复叶，其形态建成都包括叶原基的发育、叶片极性的建立、叶片大小和叶形的调控。

1 叶原基的起始发育

叶发育起始于茎顶端分生组织 （shoot apical meristem，SAM），是植物叶片形成发育的初早期阶段。通过对拟南芥、金鱼草和玉米等的一系列研究，人们揭示了叶原基在SAM周围区发育的机制，主要是很多重要的功能基因相互协调表达共同调控的作用[6]。生长素主要是通过输入载体AUXI（Auxin Resistant）和输出载体 PIN1（Pin-For-Med1）对其极性运输进行调控，在叶发育起始部位SAM周围区聚集着高浓度的生长素，通过抑制KNOX基因的活性进而促进叶原基发育[7～9]。

KNOX基因是顶端分生组织功能中重要的调控因子。KNOX1基因的高表达，可维持SAM处于分生组织形态，是SAM的特征之一。STM（SHOOT MERISTEMLESS）的stm突变体，SAM停止生长，但是能够从愈伤组织或SAM部位中形成叶片[10]。ARP基因中的PHAN、RS2（ROUGH SHEATH 2）和AS1（ASYMMETRICLEAVES 1）通过抑制KNOX基因的表达，参与调控叶原基的起始发育。AS1基因表达于叶片表皮细胞和茎顶端分生组织，当AS1基因功能缺失时，叶片的发育则出现各种形态效应[11]。另外，KNOX1通过IPT7正向调控细胞分裂素的合成，并通过抑制GA20ox的活性负调控赤霉素的生物合成，从而调控细胞增殖和分化的进程，形成新器官[8]。

2 叶片极性的建立

叶片在基因和环境因子的协调作用下，形成近-远轴、基-顶轴和中-侧轴极性3个不对称轴的过程，即叶片极性的建立[12]。

近年来，叶片的近远轴性成为研究的热点。该研究最早见于 1998 年，Waites等[13，14]从金鱼草（Antirrhinum majus） phantastica（phan）突变体中克隆分离出与叶轴面分化相关的编码MYB类蛋白的基因PHAN。研究表明，HD-ZIPⅢ基因家族中的PHB、PHV和REV基因，相互协调共同调控SAM细胞分裂向近轴面表达分化[15，16]。拟南芥AS1和AS2基因与金鱼草中的PHAN基因同源，其中AS1在叶近轴面表达，AS2则在叶近、远轴面交界的内侧表达[12]。在叶远轴化的发育过程中，KANADI基因家族、YABBY基因家族、AUXIN RESPONSIVE FACTOR（ARF）和miRNA165/166起着重要的作用。KAN基因家族中有4个功能冗余基因 （KAN1～KAN4），只有KAN1、KAN2和KAN3参与调控叶远轴面的发育过程[17，18]。KAN家族基因单缺突变体，缺陷表型表现无或不明显；而kan1 kan2双缺突变或kan1 kan2 kan3三缺突变体，缺陷表型为明显的远轴特性[19，20]。拟南芥中有6个YABBY基因，其中只有FIL、YAB2、YAB3和YAB5在叶原基远轴面和叶片边缘区进行表达[21]。

叶片极性建成过程中，基因之间存在协同促进作用和拮抗作用。参与调控远轴化的KAN基因与决定近轴化的HD-ZIPⅢ基因形成负反馈调节[22]，KAN1还通过与AS2基因中含有KAN1转录因子的保守结合位点直接结合，进而抑制AS2基因在远轴面的表达[23]。AS1/AS2既可正向调控HD-ZIPⅢ，又可负调控YAB[12,24]。KAN和ARF可正调控YAB，YAB亦能反馈促进KAN和ARF表达[20，25～27]。 异位表达miR165/166能抑制近轴面基因HD-ZIPⅢ，使叶片发生远轴化[28]。AEGONAUTE10（AGO10）与miR165/166-HD-ZIPⅢ基因的极性分布有关，可特异性识别结合miR165/166，并行使其抑制功能，从而参与调控叶片极性建成[29]。拟南芥Ta-siRNA中TAS3编码产生的tasiR-ARF可直接负调控ARF3和ARF4基因[30]，且AEGONAUTE1（AGO1）也可通过作用于miR165/166，对HD-ZIPⅢ转录物降解进行调节，从而负调控HD-ZIPⅢ家族基因的表达，改变叶的轴性[31]。

3 叶片大小的调控

叶片的大小与细胞增殖与扩大的能力有关，受植物激素、TCP基因、GRF基因、miR396等调节因子的影响。

植物激素中的生长素、细胞分裂素、赤霉素和脱落酸，均可影响植物叶大小发育。生长素能诱导AUXIN-REGULATEDGENEINVOLVEDIN ORGANSIZE（ARGOS）基因的表达。拟南芥中，ARGOS基因的表达水平改变，会直接影响叶的大小；ARGOS基因过表达时可以叶片变大，下调时叶片则会减小[32]。绿萝同时施用生长素和细胞分裂素时，能够增加其叶片的厚度和叶肉层，研究表明，细胞分裂素的调控途径可能与生长素调控植物叶生长的途径类似[33]。赤霉素通过GA20ox1的作用影响叶大小，ga20ox1突变体相较于野生型而言叶面积明显减少，而拟南芥aba2突变体与野生型相比，细胞数量减少，叶片显著变小[34]。

TCP基因家族参与叶发育途径的调控，对细胞的增殖与分化发挥着重要作用。根据保守结构域的差异，TCP蛋白分为2类：Ⅰ类，促进细胞增殖和植物生长，如水稻OsTCP12；Ⅱ类，抑制细胞增殖，如水稻OsTCP1[6]。

在拟南芥GRF基因家族中有9个成员，它们通过冗余的方式调控细胞增殖促进叶的生长发育。过表达GRF1和GRF2表现为叶显著增大，而GRF1/2/3三突变体表现为叶明显变小[35]。过表达GRF5促进细胞数目增多[8]，在ans突变体中，GRF5被下调，过表达AN3细胞数目增多、叶片增大，而ans缺失时会减缓细胞增殖速率[36]。

在拟南芥和水稻的叶发育过程中，miR396负调控TCP4和GRF的表达，而miR319抑制TCP4的表达[37，38]。

4 叶形的调控

植物叶形的丰富多样性，主要体现在叶边缘形态的多样性，可分为全缘、锯齿状、不同程度和不同形状的缺刻等。叶形性状是在复杂的基因网络调控作用下形成的，涉及众多因子。

在生长素输出途径中，生长素的流动积累方向与PIN1在细胞膜上的极性定位方向一致，并在生长素高浓度汇聚点形成了叶齿[39，40]。研究发现，矮牵牛 （Petunia hybida）中的一类转录因子NAM（NO APICAL MERISTEM）能够调控PIN1的极性定位，进而参与决定植物叶缘形态的建成[41]。CUC1（CUPSHAPED COTYLEDON 1）和CUC2（CUP-SHAPED COTYLEDON 2）为拟南芥中NAM的直系同源基因，CUC3则为旁系同源基因，其中CUC2决定叶片发育早期齿的形成，CUC3维持和保证齿的生长发育，即两者均在叶齿之间凹陷处表达，而CUC1则对叶缘不起调控作用[42～46]。在叶发育过程中，MIR164对CUC2的表达量进行负调控，从而影响叶缘形态的建立。在拟南芥的miR164突变体中，降低miR164表达量时，CUC2表达量反而升高，此时叶片缺刻加深[44]；过表达MIR164时，CUC2表达量反而降低，此时叶片为全缘叶[47]。

KNOX家族基因对植物叶缘形态发育起着非常重要的调控作用。具有全缘无缺刻叶的拟南芥中，未发现KNOX1基因表达；而在很多具羽状复叶或缺刻叶的物种，叶片中均可检测到KNOX的表达[48～50]。研究表明，KNOX基因表达异常时能引起叶缘形态的强烈变化。在拟南芥La突变体和中as1突变体均发现KNOX基因过表达时，叶缘缺刻会增多；在碎米芥中过表达KNOX基因时，小叶增加，而降低STM（KNOX基因家族成员）表达量时，抑制小叶发育，严重时形成单叶[9,51，52]。 另外，KNOX基因以负调控赤霉素的合成基因或促进细胞分裂素生物合成的方式，调控激素之间的平衡，进而控制叶缘形态的发育[51，53]。 研究发现，JLO（JAGGED LATERAL ORGANS）、JAG（JAGGED）、SAWTOOTH和Tf（Trifoliate）等也可通过KNOX途径影响叶缘形态发育[54]。

5 研究展望

近年来，随着对拟南芥叶片发育研究的不断深入，初步得到叶发育过程的调控网络。植物叶发育是一个有序而复杂的过程。目前，对叶片的近远轴性的研究较为深入，而叶片极性建立中的中边轴性和基顶轴性的建立均有待深入的研究。植物叶片的多样性和唯一性与环境息息相关，即使是同一植物其叶片也有可能存在很大差异。以叶片为经济性状的植物，叶片的优质高产，是该植物育种的主要目标；另一些植物，可以通过改变叶片形状、着生角度等调整株型，提高光能利用率，从而达到高产的目的。因此，运用现代分子生物学、基因组学、生物信息学等手段进一步深入研究叶发育分子遗传机制，不仅能完善叶发育的调控网络，还能在植物育种上开辟新的方式。