汤 洁，程庆兵，付恩桃，刘修树，范高福，方丽波

金银花即忍冬的干燥花蕾，味甘，性寒，具有清热解毒、疏风散热之功效。金银花的活性成分主要有黄酮类、有机酸类、挥发油、三萜类，其中以有机酸类的绿原酸、异绿原酸生物活性显著，具有抗菌(烟曲霉、大肠埃希菌)[1-2]、抗氧化、抗炎[3]、抗病毒，参与人体血小板凝集和凝血因子的生成等作用[4]。因此，有机酸类的活性成分一直是衡量金银花提取效率优劣的重要指标。

本实验参照文献[5-7]，优化了一个简便的高效液相色谱法(HPLC)同时检测金银花中绿原酸及异绿原酸A含量的方法，并采用正交设计的方法探讨金银花提取工艺的最佳条件。王玥等[8-9]运用HPLC法已验证绿原酸作为单一指标回流法显著优于超声法，在这基础上，我们将超声波与传统醇回流提取联用，一方面利用超声波技术的空化作用，能有效缩短整个提取工艺的时间，提高提取效率，另一方面拟解决回流法弥补超声波提取绿原酸量低的问题。现作报道。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药品级主要试剂 金银花药材购自亳州市永刚饮片厂有限公司；绿原酸对照品(批号110753-201716)购自中国食品药品检定研究院，异绿原酸A对照品(批号B21539，纯度≥98%)购自上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸、95%乙醇为分析纯，水为屈臣氏饮用水。

1.1.2 实验仪器 戴安U3000型高效液相色谱仪(包括HPG-3400SD泵，自动进样器，DAD-3000型检测器，Chromeleon 7.0 工作站)；Mettler Toledo XPE 205型分析天平(0.01 mg)，JP300G型超声波提取机组，FXB系列小型中药粉碎机，RE-52AA型旋转蒸发器，SHZ-D(Ⅲ)型循环水真空泵。

1.2 实验方法

1.2.1 绿原酸、异绿原酸A的测定

1.2.1.1 色谱条件 Waters SunFire C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流动相为0.4%磷酸溶液∶乙腈为87∶13，流速1.0 mL/min，进样量10 μL，检测波长326 nm，柱温40 ℃。

1.2.1.2 混合对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品10.390 mg、异绿原酸A 对照品9.995 mg，分别置25 mL 棕色容量瓶中，加50 %甲醇超声溶解稀释至刻度，制成质量浓度分别为415.60、399.80 μg/mL的绿原酸、异绿原酸A对照品的储备液。分别精密移取绿原酸、异绿原酸A各2 mL定容于25 mL的棕色容量瓶中，制成每1 mL含绿原酸33.248 μg、异绿原酸A 31.984 μg的混合对照品溶液。

1.2.1.3 供试品溶液的制备 精密称定过五号筛的金银花细粉5.0 g，加15倍量乙醇[8]超声、回流提取，抽滤，减压浓缩至浸膏，用50%甲醇溶解并定容至50 mL，摇匀，4 000 r/min离心12 min，取上清液1 mL，用50%甲醇定容至25 mL后，再取3 mL定容至10 mL的棕色容量瓶中备用。

1.2.1.4 标准曲线的制备 分别精密吸取混合对照品溶液2、4、5、8、10、12 μL按色谱条件进样，以峰面积Y为纵坐标，以进样量X(μg)为横坐标，计算绿原酸、异绿原酸A线性回归方程。

1.2.1.5 精密度实验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，按色谱条件连续重复进样6次，计算绿原酸、异绿原酸A色谱峰面积的相对标准偏差(RSD)。

1.2.1.6 重复性实验 精密称定6份5.0 g金银花药材细粉，60%乙醇经200 W超声15 min处理，0.5 h回流提取1次，按1.2.1.3项制备供试品溶液，记录峰面积，计算RSD。

1.2.1.7 稳定性实验 分别于0、2、4、8、12 h，精密吸取同一供试品溶液进样，计算色谱峰面积的RSD。

1.2.1.8 加样回收率实验 精密称取已知含量的药材粉末约50 mg，60%乙醇经200 W超声15 min处理，0.5 h回流提取1次，按1.2.1.3项制备供试品溶液，精密加入高、中、低3个不同浓度的对照品储备液适量，每个浓度各做3份，计算各自的含量。

1.2.2 正交试验优化金银花最佳提取方法[8-10]精密称定金银花细粉(过五号筛)5.0 g，选用 L9(34)正交表进行试验，因素与水平见表1。药材加15倍量乙醇经超声处理1次，回流提取1次，抽滤，减压浓缩至浸膏，按1.2.1.3项制备供试品。

表1 因素水平

2 结果

2.1 绿原酸、异绿原酸A的测定

2.1.1 色谱条件 在1.2.1.1项下测得混合对照品和供试品溶液分离度良好，色谱图见图1。

2.1.2 线性关系 绿原酸在0.066 5～0.399 0 μg，异绿原酸A在0.064 0～0.383 8 μg的质量范围内线性关系良好。线性回归方程分别是，绿原酸：Y=34.085 84X+0.229 7(r=0.999 91)，异绿原酸A：Y=40.246 95X+0.206 73(r=0.999 12)。

2.1.3 实验结果 精密度：计算得绿原酸、异绿原酸A的RSD分别为0.32%、0.40%。表明仪器精密度良好。重复性：绿原酸、异绿原酸A的RSD分别为1.05%、1.17%。表明该方法的重复性良好。稳定性：绿原酸、异绿原酸A的RSD分别为0.45%，0.73%。表明供试品溶液在12 h内稳定。加样回收率实验：计算得到绿原酸、异绿原酸A 的平均回收率分别是99.63%、100.18%，RSD分别为1.76%、1.89%(见表2)。

2.2 正交试验优化金银花最佳提取方法 绿原酸、异绿原酸A的提取结果：分别吸取正交试验条件下的供试品溶液按1.2.1.1项色谱条件进样，依法测定绿原酸、异绿原酸A的质量分数。对正交试验结果进行直观分析结果见表3，方差分析见表4～5。

表2 加样回收率实验结果

以绿原酸质量分数为指标进行直观分析(见表3)，影响因素的顺序是A>D>B>C，即乙醇浓度>超声时间>回流时间>超声功率。最佳提取工艺为A1B2C3D3，即60%乙醇超声(功率500 W)45 min，再回流提取1 h。以偏差平方和最小的因素为误差项进行方差分析(C因素)(见表4)。结果表明A因素有统计学意义，B、D因素无统计学意义。

以异绿原酸A质量分数为指标进行直观分析，影响因素的顺序是C>A>B>D，即超声功率>乙醇浓度>回流时间>超声时间。最佳提取工艺为A1B2C3D1，即60%乙醇超声(功率500 W)15 min，再回流提取1 h(见表3)。以偏差平方和最小的因素为误差项进行方差分析(D因素)(见表5)。结果表明A、B、C因素均无统计学意义。

综合评估金银花提取效果，以绿原酸和异绿原酸A的质量分数为指标，权重系数各为50进行计算，得“综合评分=绿原酸质量分数/27.24×50+异绿原酸A质量分数/17.43×50”。以综合评分为指标进行直观分析，影响因素的顺序是A>C>B>D，结果表明A、B、C因素无显著性差异。即乙醇浓度>超声功率>回流时间>超声时间。最佳提取工艺为A1B2C3D3，即60%乙醇超声(功率500 W)45 min，再回流提取1 h(见表3)。以偏差平方和最小的因素为误差项进行方差分析(D因素)，结果表明A、B、C因素差异无统计学意义(见表6)。

表3 正交试验安排及结果

表4 绿原酸方差分析

表5 异绿原酸A方差分析

表6 绿原酸、异绿原酸A方差分析

3 讨论

本研究建立了HPLC同时测定金银花中绿原酸和异绿原酸A的方法，该方法快捷、简便、稳定。选择流动相为0.4%磷酸溶液∶乙腈=87∶13的等度洗脱，波长为326 nm，检测的绿原酸和异绿原酸A的峰响应均较高，在22 min内可以完成出峰，且各峰间的分离度符合要求，特异性显著。

通过分析正交试验表4～6的结果分析，单以绿原酸为指标，最佳提取工艺是60%乙醇超声(功率500 W)45 min，再回流提取1 h；且60%的乙醇提取(P<0.05)。以绿原酸、异绿原酸A的综合评分为指标，最佳提取工艺是60%乙醇超声(功率500 W)45 min，再回流提取1 h。该方法采用超声辅助醇提，在实际生产中可取消药材浸泡的环节，缩短提取时间，此种方法经济、快捷，提取效率高。原因是超声波提取产生的空化作用可以加快固液之间的传质，加速药材中有效成分的浸出。

金银花提取工艺中绿原酸和异绿原酸A的提取效率不太高的原因可能与金银花药材的产地有关，即不同产地的金银花药材其绿原酸、异绿原酸A的含量存在差异；药材在常压回流水浴的温度达89 ℃，较高的温度可能使绿原酸与异绿原酸A的结构发生变化，后期可采用减压回流的提取方式使60%乙醇提取溶剂的沸点降低，增加回流的效率。