谭琳娜,谭玉勇,鲁嘉熙,刘德良

(中南大学湘雅二医院消化内科,中国湖南长沙410011)

ULK1(unc-51 like autophagy activating kinase 1)是哺乳动物丝/苏氨酸激酶,其N端为激酶活性区域,中间为丝/脯氨酸富含区域,C端为含有PDZ结合模序(PDZ-binding motif)的保守区域[1]。在哺乳动物中,ULK1通常与相对分子质量大小为200 kD的黏着斑激酶家族相互作用蛋白(focal adhesion kinase family interacting protein of 200 kD,FIP200)、自噬相关蛋白-13(autophagy related protein-13,ATG13)及自噬相关蛋白-101(autophagy related protein-101,ATG101)结合形成自噬起始复合物来介导自噬反应[2～3]。

在自噬起始复合物中,FIP200缺失可破坏ULK1的磷酸化、结构稳定性以及自噬起始[4];ATG13与ULK1的结合可加强ULK1的结构稳定性,同时促进ULK1对FIP200的磷酸化[2,5]。而ATG101可以直接与ATG13的HORMA结构域结合并防止ATG13被溶酶体降解,使得ATG13稳定存在[6～7]。同时,ATG101的C端结构域起连接ULK1与Ⅲ型磷脂酰肌醇-3激酶复合体-1(classⅢphosphatidylinositol 3-kinase complex Ⅰ,PI3KC3-C1)的作用[8]。此外,ATG101可招募下游因子聚集在自噬体(autophagosome)周围,促进自噬体形成和成熟[6]。

在经典自噬途径中,细胞外界营养条件的变化(如葡萄糖、氨基酸和氧气等)会分别激活腺苷一磷酸活化的蛋白激酶(adenosine monophosphateactivated protein kinase,AMPK)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物-1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1),这两个分子可磷酸化ULK1的不同磷酸化位点,分别产生激活自噬和抑制自噬两个相反的结果[9]。此外,相关研究在激活后的ULK1的晶体结构上发现,第180位苏氨酸有自我磷酸化现象(autophosphorylation),表明ULK1激活除了依赖AMPK和mTORC1的磷酸化之外,还依赖自我磷酸化[10]。

近年来越来越多的研究发现,除了介导经典自噬反应外,ULK1也介导或参与了许多不依赖自噬途径的重要反应,如促进细胞凋亡[11]、强化磷酸戊糖途径[12]、调控固有免疫反应[13～14]等。而且,ULK1 在应激[15～16]、糖脂代谢[12,17～18]、肿瘤[19～33]、神经系统疾病[34～40]中也发挥着重要作用。鉴于ULK1的重要性,本综述围绕ULK1蛋白激酶参与的经典自噬反应和不依赖自噬的反应及其介导的生理、病理和疾病过程展开论述。

1 ULK1介导自噬的经典通路

1.1 AMPK-ULK1-PI3KC3-C1介导的自噬激活途径

AMPK是高度保守的真核细胞能量感应器/检查点,当葡萄糖缺乏时,细胞内ATP浓度下降,使AMPK被激活,后者会通过调节多种代谢酶的活性来抑制合成代谢、促进分解代谢[41]。在此过程中,AMPK会使ULK1第317位和第777位丝氨酸发生磷酸化,激活ULK1激酶活性[9]。此外,ULK1同时会发生自我磷酸化[10]并发挥激酶活性磷酸化自噬起始复合物的FIP200和ATG13[2]。

被激活的自噬起始复合物通过磷酸化PI3KC3-C1的自噬相关蛋白-6(autophagy related protein-6,ATG6/Beclin-1)亚单位上的第 14[42]、30[43]位苏氨酸激活PI3KC3-C1,后者继续磷酸化磷脂酰肌醇以形成1,2-棕榈酰磷酯酰肌醇-3-磷酸(phosphatidylinositol 3-phosphate,PI3P)[44]。PI3P不仅是双层膜(phagophore)的基本组成部分,它还可以招募其他自噬相关的分子,共同促进封闭的自噬体的形成[44]。双层膜在延伸时,会包裹废弃的细胞器和蛋白质,当已经封闭的自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体时,被包裹的细胞器和蛋白质即被溶酶体内的水解酶降解[45]。ULK1可通过招募突触融合蛋白-17(syntaxin-17,STX17)并增加STX17与突触体相关蛋白-29(synaptosomal-associated protein-29,SNAP29)的亲和力促进自噬体与溶酶体融合,而蛋白激酶Cα磷酸化ULK1可阻止这一过程[46]。此外,ULK1可以负反馈磷酸化AMPK的3个亚单位以抑制AMPK的活性,从而控制自噬的时间和幅度[47]。AMPK磷酸化ULK1第555位丝氨酸可抑制自噬体形成[48]。

许多辅因子对PI3KC3-C1激酶复合物的活性必不可少。其中,辅因子Ambra1(activating molecule in Beclin 1 regulated autophagy-1)能与 ULK1、PI3KC3-C1激酶复合物结合,维持ULK1的结构稳定性和激酶活性[49]。此外,Ambra1还能被ULK1磷酸化修饰,从而诱导Ambra1-PI3KC3-C1复合物从细胞骨架向内质网移位[50]。

AMPK磷酸化ULK1还可以使ULK1从胞浆转位至线粒体或溶酶体,促进线粒体自噬(mitophagy)[51]。线粒体自噬是细胞通过自噬消化老化和受损的线粒体的过程。热休克蛋白-90(hot shock protein-90,Hsp90)与其辅分子伴侣Cdc37(cell division cycle control protein-37)结合后可与ULK1结合,以促进其稳定性和激酶活性,从而维持线粒体自噬[52]。此外,ULK1可磷酸化线粒体外膜蛋白FUNDC1(FUN14 domain containing 1)的第17位丝氨酸,加强后者与微管相关蛋白-1轻链-3(microtubule associated protein 1 light chain 3 alpha,LC3)的相互作用,促进线粒体自噬[53]。剪切体蛋白 PRPF8(pre-mRNA processing factor 8)可通过维持ULK1 mRNA正确剪切保护正常的线粒体自噬功能[54]。

1.2 mTORC1-ULK1介导的自噬抑制途径

mTORC1复合物是重要的能量代谢枢纽,其主要作用是促进合成代谢,如蛋白质合成,以促进细胞生长和增殖[55]。当细胞处于正常的营养代谢状态下时,mTORC1的Raptor(regulatory associated protein of mTOR complex 1)亚单位会与ULK1结合,随后mTORC1的mTOR亚单位磷酸化ULK1的第757位苏氨酸。该磷酸化可使ULK1失活,并且阻断ULK1与AMPK的联系[55～56]。当细胞氨基酸尤其是谷氨酰胺、亮氨酸和精氨酸缺乏时,mTORC1脱离ULK1,ULK1恢复自身活性并且与AMPK重新结合,进而启动自噬[57]。

此外,ULK1也可以对mTORC1产生负反馈抑制作用。ULK1可以磷酸化Raptor亚单位的第696、792、855、859、863、877 位丝氨酸和第 706 位苏氨酸,以抑制mTORC1信号通路[58]。ULK1诱导的Raptor亚单位磷酸化和mTORC1信号通路抑制可阻碍细胞增殖[59]。

2 ULK1蛋白激酶的降解

泛素化(ubiquitination)是最常见的蛋白质降解途径之一。目前,人们发现的ULK1降解都是经过泛素-蛋白酶体途径。去泛素化酶抑制剂WP1130可促进ULK1泛素化及转移至聚集小体[60]。在长期营养剥夺条件下,泛素连接酶Cul3-KLHL20(cullin 3-kelch like family member 20)[61]可通过 kelch重复结构域直接泛素化ULK1,导致ULK1通过泛素-蛋白酶体途径降解和自噬终止[62～63]。E3泛素连接酶NEDD4L(neural precursor cell expressed,developmentally down-regulated 4-like)通过泛素化ULK1第925、933位赖氨酸使得ULK1通过泛素-蛋白酶体途径降解[64]。E3泛素连接酶肿瘤坏死因子受体相关因子-6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)在依赖Ambra1的条件下可以泛素化ULK1第63位赖氨酸,使ULK1通过泛素-蛋白酶体途径降解,而mTORC1的mTOR亚单位对Ambra1第12位苏氨酸的磷酸化可阻止这一进程[49]。此外,在线粒体自噬中,ULK1转移到线粒体后,可被线粒体外膜上的E3泛素连接酶MUL1(mitochondrial E3 ubiquitin protein ligase 1)泛素化降解[65]。反之,去泛素化酶USP1(ubiquitin specific peptidase 1)[66]、USP20(ubiquitin specific peptidase 20)[67]可结合并稳定ULK1,防止其被泛素化降解。

3 ULK1参与的生理过程

3.1 糖代谢和脂代谢

葡萄糖和多种氨基酸的缺乏都可激活ULK1介导的自噬反应。除此之外,活化的ULK1可直接结合并磷酸化几个糖酵解关键酶,如己糖激酶、磷酸果糖激酶-1、果糖-1,6-二磷酸酶和烯醇酶-1。此作用可强化磷酸戊糖途径,提供大量NADPH,为细胞各种反应提供还原剂[12],提高细胞生存能力。

相关研究显示,心脏特异性ULK1敲除小鼠模型出现了心肌脂蛋白脂酶的堆积,而加强肥胖小鼠模型心肌细胞的自噬能力后可有效降低心肌脂蛋白脂酶的堆积,减少甘油三酯[17]。脂肪细胞特异性ULK1敲低同样可降低基础脂解能力,并且还会降低脂肪酸摄入及合成[18]。总之,ULK1介导的自噬反应可帮助维持细胞脂解能力。

因此,ULK1除了受到内环境中营养物质波动的影响之外,还可以直接影响糖代谢和脂代谢,并且活化的ULK1可强化细胞供能、降低脂肪堆积,提高细胞活力。

3.2 网织红细胞成熟

ULK1介导的线粒体自噬可能在网织红细胞向成熟红细胞发育的过程中参与了线粒体的清除。网织红细胞的成熟势必伴随着线粒体、核糖体以及其他细胞器的清除。研究发现,随着正染性成红细胞以及成红细胞的比例升高,ULK1的表达量也升高。并且,ULK1敲除导致网织红细胞线粒体清除延迟或不清除,同时RNA滞留以及CD71 表达消失[68]。

4 ULK1参与的病理和疾病过程

4.1 线粒体氧化应激和内质网应激

在线粒体自噬过程中,当ULK1进入线粒体后,可抑制锰超氧化物歧化酶的活性并促进活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生,甚至可进一步诱导凋亡[11]。进一步研究发现,线粒体ROS积累可降低胞浆p70S6K激酶的磷酸化,抑制p53第392位丝氨酸的磷酸化,进而减少p53蛋白对ULK1的转录激活作用,降低自噬反应[69]。这表明线粒体的氧化应激程度越高,细胞越倾向于凋亡而非自噬。此外,氧化应激可促进ULK1入核,稳定并且激活DNA损害修复蛋白聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1(poly(ADP-ribose)polymerase 1,PARP1)的转录后修饰活性[70],加速ATP消耗和细胞凋亡[71]。值得注意的是,无论是抑制锰超氧化物歧化酶活性还是入核后激活PARP1,都是ULK1独立于经典自噬过程发挥的促凋亡作用。

多种细胞内外环境的变化,如缺氧、低糖、酸中毒等,可使内质网中未折叠蛋白质及错误折叠蛋白质的数量增多,从而引起内质网蛋白质折叠功能超负荷,导致内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)[72]。内质网应激可降低糖原合成酶激酶-3β (glycogen synthase kinase 3 beta,GSK3β)第9位丝氨酸的磷酸化,使得TIP60(Tat interactive protein 60 kD)第86位丝氨酸的磷酸化增强。而该位点的磷酸化可促进TIP60的乙酰转移酶活性,引起ULK1乙酰化激活,加强自噬反应,使废弃或受损的蛋白质、细胞器被及时消化、降解,维持细胞生存[15～16]。

总之,无论是线粒体氧化应激还是内质网应激,都是由于内外界刺激导致细胞内环境紊乱,根据刺激程度不同,ULK1发挥的作用不同。当刺激程度较轻时,ULK1介导的自噬活动增强,清除受损细胞器,维持细胞生存。然而当刺激程度较高时,细胞内错误折叠的蛋白质增多,蛋白质负荷超过自噬清除能力极限,ULK1开始激活细胞调亡程序,促进细胞死亡,降低能量浪费。

4.2 Ⅰ型干扰素相关固有免疫反应

人体固有免疫系统发挥的入侵病毒清除作用主要依赖于Ⅰ型干扰素(typeⅠinterferon,typeⅠIFN)。TypeⅠIFN已被用来治疗病毒感染、调节免疫,甚至治疗肿瘤[73～74]。在 AKT(AKT serine/threonine kinase 1)存在的情况下,typeⅠIFN诱导ULK1第757位丝氨酸的磷酸化和激活,并且在p38 MAPK(p38 mitogen-activated protein kinase)存在的条件下,ULK1活化进一步促进IFN刺激基因(IFN-stimulated gene,ISG)的转录激活,如IRGM2(immunity-related GTPase family M member 2)、GCH1(GTP cyclohydrolase 1)、IFIT3(interferon induced protein with tetratricopeptide repeats 3)、OASL2(2′-5′oligoadenylatesynthetase-like 2)、IRF7(interferon regulatory factor 7)、IRF9 和 IFIT2,进而发挥IFN的固有免疫作用[9]。ULK1介导的MAP-3K11(mitogen-activated protein kinase kinase kinase 11)和MAPK7活化同样对typeⅠIFN的抗病毒作用必不可少[13]。此外,ULK1缺失可抑制typeⅠIFN的抗病毒、抗增殖能力[14]。

IFN基因刺激因子(stimulator of interferon gene,STING)可以察觉核内异常DNA并直接转录激活typeⅠIFN、IFN调节因子-3(interferon regulatory factor 3,IRF3)和 NF-κB[75～78]。当出现持续性 DNA损伤时,ULK1可以通过磷酸化STING的第366位苏氨酸抑制STING活性,降低typeⅠIFN和IRF3 的表达[79]。

综上所述,ULK1不仅介导了typeⅠIFN的固有免疫作用,当免疫作用过强引起持续性DNA损伤时,ULK1还可以通过STING间接抑制typeⅠIFN的内源性表达,减少细胞的免疫伤害。

4.3 神经系统疾病

小鼠在受到创伤性脑损伤后,下丘脑中ULK1的表达会上调,而敲除ULK1能改善小鼠的认知能力和下丘脑神经元的存活能力,降低神经炎症反应和神经元凋亡,减少胶质细胞增生[34]。在小胶质细胞炎症模型中,p38α MAPK可磷酸化ULK1并抑制其激酶活性,阻止其与ATG13的结合,进而抑制自噬反应[35]。

第九号染色体的第72个开放阅读框(chromosome 9 open reading frame 72,C9orf72)包含一段六核苷酸重复序列GGGGCC,该重复序列在脊髓侧索硬化和额颞痴呆患者中出现特征性突变,即GGGGCC可重复数百至数千次[36～37]。C9orf72蛋白可与 SMCR8(SMCR8-C9orf72 complex subunit)、WDR41(WD repeat domain 41)和ATG101结合形成复合物。研究表明,C9orf72在保持与SMCR8结合的状态下可与ULK1结合,C9orf72、SMCR8缺失都可减弱自噬反应[38]。因此ULK1介导的自噬反应可能在脊髓侧索硬化和额颞痴呆的病程中也发挥着一定作用。

此外,精神分裂症患者的外显子测序显示ULK1基因有4个无义突变[39]。ULK1激动剂33i(BL-918)通过自噬反应在帕金森病小鼠模型中起到多巴胺神经元保护作用[40]。

总之,以上多项研究表明ULK1可在神经系统疾病患者的预后中发挥多重作用,如抑制自噬可能改善脑损伤患者预后,而激活自噬可能保护帕金森病患者的多巴胺神经元。

4.4 肿瘤

已有研究报道,ULK1抑制剂SBI-0206965显著抑制神经母细胞瘤[19]、肾透明细胞癌[20]的细胞生长并促进其凋亡,ULK1敲低可延长神经母细胞瘤、肾透明细胞癌裸鼠模型的生存期;ULK1抑制剂MRT 68921增强了人间皮瘤体外3D模型的化疗敏感性[21]。这些实验结果提示,抑制肿瘤细胞自噬活性可能会改善神经母细胞瘤、肾透明细胞瘤及间皮瘤患者的预后。此外,在前列腺癌[22]、食管鳞状细胞癌[23～24]、肝细胞癌[25]、肾透明细胞癌[26]中,肿瘤组织ULK1的表达量与患者预后呈负相关,表明ULK1及其介导的各种生理病理过程在这些肿瘤类型中可能发挥促癌作用。

在非转移侵袭性乳腺癌组织中,ULK1表达量下降,且其表达量与肿瘤大小、肿瘤病理分级和淋巴结转移负相关,与患者生存期正相关[27]。此外,ULK1激动剂LYN-1604可促进乳腺癌细胞死亡[28～29]。在胃癌中,ULK1表达量与患者生存期正相关[30]。因此,ULK1在乳腺癌、胃癌中可能发挥着与在神经母细胞瘤和肾透明细胞癌中不同的作用。这一发现表明,一方面,ULK1介导的各种生理病理过程可能在不同肿瘤中占不同的权重;另一方面,ULK1可能在特定肿瘤类型中由不同的癌蛋白/抑癌蛋白激活,且发挥着一些尚未被发现的作用。比如:在DNA损伤的情况下,抑癌蛋白p53可直接转录激活ULK1,产生持久的自噬反应[69,31];然而,癌蛋白PPM1D(protein phosphatase,Mg2+/Mn2+dependent 1D)可以通过磷酸化p53第15位丝氨酸使p53降解,同时使ULK1第673位的丝氨酸去磷酸化,进而抑制ULK1活性,减弱自噬反应[32]。

总之,ULK1介导的各种生理病理过程在不同的肿瘤种类、不同时间节点扮演着不同的角色,既可发挥促癌作用亦可发挥抑癌作用。一方面,在细胞癌变早期,当细胞面临缺氧、内质网应激等应激反应时,增强的自噬反应可加快有毒物质、错误折叠蛋白质及破损细胞器的降解,减少癌变发生。另一方面,当肿瘤已经形成时,肿瘤的高复制、多突变、高代谢状态会增大肿瘤细胞的蛋白质负荷,通过升高 ULK1以及增强ULK1介导的经典自噬反应降解错误折叠的蛋白质和破损细胞器,肿瘤细胞可以维护自身的生存[33]。因此,是否能通过调节ULK1以及在何时点调节ULK1能够有效改善肿瘤患者预后仍有相当大的研究空间。

4.5 其他

ULK1在其他系统中也发挥着特殊作用,目前的研究虽尚未成系统,但也做了一些初步的探索。比如:中波紫外线照射可下调人角质细胞ULK1表达,进而减少细胞自噬[80];AMPK激活的ULK1有助于维持胚胎干细胞的自我更新和多能性[81];ULK1可磷酸化Wnt信号通路中Dsh(dishevelled)的多个位点,可能对Wnt信号产生影响[82];ULK1可磷酸化肾闰细胞盐皮质激素受体配体结合区域的第843位丝氨酸,从而维持水盐平衡[83]。

此外,在病理活动中,雷帕霉素诱导的mTORC1-ULK1-ATG13通路的激活有可能缓解慢性非菌性前列腺炎大鼠模型的炎症反应[84]。肝特异性ULK1敲除可减少对乙酰氨基酚引起的肝损伤[85]。总的来讲,ULK1在多种脏器的病理活动中发挥的作用仍等待着进一步的研究。

5 总结与展望

自噬反应广泛存在于人体的各种细胞中,无论是ULK1通过自噬-溶酶体途径发挥的经典自噬反应,还是其发挥的独立于自噬之外的稳定氧化应激和内质网应激、降脂、促进红细胞成熟、调控固有免疫反应等作用,都说明了ULK1在正常生理活动和调控病理、疾病进程中不可替代的地位。然而,ULK1在多种神经系统疾病中的具体作用仍然未知,能否通过抑制自噬改善脑损伤患者预后或通过激活自噬改善帕金森病患者预后仍需进一步的动物实验证实。而且,ULK1显然在不同肿瘤中发挥着多重作用,能否针对特定肿瘤的特定发展阶段开发ULK1靶向药物进而延缓肿瘤进程,仍是未来一段时间的研究方向。此外,针对ULK1在皮肤、肾、肝等组织器官的特殊作用的研究仍较少,尚未成系统。因此,继续进行更多的针对ULK1的细胞、动物、临床试验以及开发更多靶向ULK1的有效药物仍然是未来很长一段时间的研究方向。