张英楠,黄佳星,梁欣然,李 芽,于书海,王 郑

(内蒙古大学生命科学学院,中国内蒙古呼和浩特010021)

受精是单倍体的精子和单倍体的卵子在雌性动物输卵管内相遇、识别、黏附并融合形成一个新的二倍体生物的过程[1]。一直以来,许多科学家都致力于揭示哺乳动物受精作用之谜。随着体外受精技术的发展,受精在细胞层面已经得到很好的阐述。精子在雌性生殖道内获得使卵细胞受精的能力,通过顶体反应让之前隐藏的受体蛋白质暴露于表面。一旦受精,卵黄膜和透明带都会发生生化改变,使卵子不会接受额外的精子,从而减少出现不能存活的多倍体胚胎的可能性。然而,精卵融合过程到底涉及到哪些受体蛋白质？在介导精卵融合过程中这些蛋白质又如何发生相互作用？相关的分子机制仍不十分明确。在以往的研究中,研究者提出了许多可能参与精卵质膜融合的关键分子,如SPESP1(sperm equatorial segment protein 1)、CRISP2(cysteine-rich secretory protein 2)、TSSK6(testis-specific serine kinase 6)等[2～4]。但科学家们通过基因敲除实验发现,这些候选分子只是参与精卵的融合过程,并不是精卵融合必不可少的因素。目前通过基因敲除实验已经证实IZUMO1、JUNO 和 CD9(cluster of differentiation antigen 9)为精卵融合过程中的必需蛋白质,且主要在精卵融合最初的黏附过程中共同发挥作用。本文对哺乳动物精卵融合必需蛋白质IZUMO1-JUNO/CD9的结构、功能和分子机制的研究进展进行阐述。

1 IZUMO1-JUNO复合物

1.1 IZUMO1蛋白

IZUMO1最早是通过精子单克隆抗体OBF13抑制精子与去透明带的卵子结合而发现的[5～6]。IZUMO1是免疫球蛋白超家族的成员,属于I型膜蛋白,由胞外区域的免疫球蛋白样结构域、单次跨膜结构域和短胞质尾组成。CRISPR/Cas9介导的突变实验表明,短胞质尾对于IZUMO1受精功能不是必需的:短胞质尾能调节IZUMO1的表达量,但不参与IZUMO1易位和精卵融合过程[7]。哺乳动物IZUMO1家族蛋白的N-末端有一个含接近150个氨基酸的“IZUMO结构域”,“IZUMO结构域”含8个半胱氨酸残基,决定IZUMO1的生物活性[8]。胞外区的免疫球蛋白样结构域有一个相对保守的N-聚糖,它能够在睾丸尾部保护IZUMO1不被降解[9]。单次跨膜结构域和短胞质尾具有睾丸组织特异性,在发生顶体反应后的精子质膜区表达[10]。Young等[11]发现,IZUMO1的短胞质尾区域在IZUMO1重新定位时会高度磷酸化。

在受精过程中,成熟的精子发生顶体反应穿过透明带,会使IZUMO1从顶体内膜下重新定位到精子赤道段。而IZUMO1正确的重新定位对于精卵融合是至关重要的。Fukuda等[12]在2016年发现,公牛冷冻精子的受精能力受损可能与IZUMO1的异常异位有关。Zhou等[13]认为,IZUMO1重新定位还可以帮助卵母细胞选择能够进行精卵融合的精子。

1.2 JUNO蛋白

2014年,Bianchi等[14]确认了小鼠卵细胞的叶酸受体4(folate receptor 4,Folr4)就是IZUMO1的受体蛋白质。由于叶酸受体4不具有和叶酸结合的能力,故而发现者建议将其更名为JUNO。JUNO是一种锚定蛋白,通过对JUNO进行免疫染色定位发现,JUNO在生发泡期(germinal vesicle,GV)的卵母细胞中表达,并会继续以类似的水平在卵母细胞成熟的后期阶段表达[15]。

哺乳动物的IZUMO1和JUNO在正向选择下共同进化[16]。早在1976年Jaffe[17]就已经发现,在IZUMO1与JUNO相互作用后,卵子膜会迅速地去极化以阻止多精入卵。后来人们通过比较小鼠卵子膜阻止多精入卵的时间与JUNO在卵子上消失的时间发现,在哺乳动物中也有IZUMO1与JUNO相互作用阻止多精入卵的现象[18]。而且,受精后JUNO会从卵黄膜表面快速消失以防止多精入卵,确保卵子在正常情况下只与一个精子结合。

1.3 IZUMO1-JUNO复合物的作用

在izumo1基因敲除实验中,敲除izumo1的雄性小鼠仍具有正常的交配行为,且射精形成正常阴道栓,但无法产生后代。而直接给卵子胞质中人工注射izumo1-/-,精子能够形成受精卵并进一步发育[6]。这说明IZUMO1的功能似乎只与精卵膜融合有关。近年来研究发现,表达IZUMO1的Cos7细胞与卵母细胞只能黏附而不能融合[8,19],野生型精子与表达JUNO的HEK293细胞的相互作用也是如此[20]。黏附是精卵融合的前提,IZUMO1-JUNO复合物在精卵黏附时具有相互作用。2015年Bianchi等[21]证明来自叙利亚金仓鼠的JUNO可以直接和人类的IZUMO1产生相互作用。这个实验结果再一次印证了人类和小鼠体内的IZUMO1和JUNO在细胞间的黏附作用过程中是保守的[22]。

2 IZUMO1-JUNO识别系统

2.1 IZUMO1-JUNO复合物的晶体结构

2016年,科学家们通过测定IZUMO1的晶体结构发现,在pH不同的环境下,人的IZUMO1为细长的棒状或飞镖形状结构[19,23～24]。IZUMO1由一个螺旋束状的“IZUMO结构域”和免疫球蛋白结构域组成,两者之间是一个β-发夹体。“IZUMO结构域”和免疫球蛋白结构域通过4个保守的二硫键牢固地锚定在β-发夹体上[19]。JUNO是内为袋状的球状结构,其晶体结构整体折叠成类似于叶酸受体FRα和FRβ的形状,由折叠核心和3个表面暴露的柔韧区组成[19～20]。IZUMO1 的 β-发夹体与JUNO配体结合口袋的后表面结合[19]。IZUMO1与JUNO识别的方式为IZUMO1的α-螺旋结构域与JUNO表面的槽产生相互作用[25];准确来说,是JUNO上的Trp62与IZUMO1的核心区域——α-螺旋上的疏水残基产生相互作用,以1︰1 的形式形成复合体[19～20]。

Aydin等[24]发现,人类IZUMO1与JUNO形成高亲和力复合物时,IZUMO1构象在其N-末端结构域内发生如下变化:IZUMO1未与JUNO结合时采用单体精子膜表面的回旋构象,绑定到JUNO卵子受体后,IZUMO1的4HB区域朝着卵母细胞膜迁移,而且IZUMO1的铰链区在JUNO的作用下,将其稳定的“锁定”到直立位置。

2.2 IZUMO1-JUNO复合物的分子机制

IZUMO1和JUNO之间的相互作用亲和力非常弱,其复合物单体半衰期约为0.5 s[26]。我们由此提出疑问:IZUMO1和JUNO之间如此弱的相互作用是怎样将精子和卵母细胞“绑定”的呢？科学家们发现IZUMO1在顶体内是单体形态,在精子表面能与其他蛋白质形成复合物,且其N-末端结构域具有形成二聚体的能力[27～28]。Inoue等[29]认为,JUNO首先与单体IZUMO1结合,然后逐渐聚集在精子的接触面,诱导IZUMO1二聚化来增强精子与卵母细胞之间的附着力。2016年Nishimura等[30]发现,IZUMO1的结构与疟原虫孢子阶段表达的入侵蛋白质SPECT1(sporozoite microneme protein essential for cell traversal 1)和TRAP(thrombospondin repeat anonymous protein)的结构十分相似,推测IZUMO1以类似于某些病毒融合的方式,作为支架招募其他精子或卵伴侣蛋白,形成多蛋白质融合。目前还不清楚触发精卵融合是否需要IZUMO1-JUNO复合物,触发精卵融合的机制有下列3种假设:第一种是异型的IZUMO1与JUNO组成的复合物或IZUMO1二次构象的改变触发了精卵融合;第二种是在形成IZUMO1-JUNO复合物后,IZUMO1通过硫醇-二硫化物交换反应,使整个结构朝向精子膜侧弯曲且使IZUMO1二聚化,从而触发精卵融合[29];第三种是卵细胞膜和精子膜经历系列变化形成融合孔,实现膜融合,从而触发精卵融合[24]。

JUNO在与单体IZUMO1形成复合物时,通过PDI相关蛋白质重建IZUMO1的整体结构。这种重排可以克服并置膜之间的排斥,使得IZUMO1的N-末端折叠到分子的内侧。然后二聚体与卵母细胞其他受体结合,使并置的磷脂双分子层更加靠近[28]。随后JUNO迅速消失,IZUMO1不再与JUNO结合。有研究表明,IZUMO1在大多数缺乏JUNO的界面上,仍然可以和卵母细胞紧密结合[31]。可见卵母细胞侧会有其他未识别的IZUMO1受体参与精卵融合。

3 CD9与IZUMO1-JUNO的共同作用

2000年,3个独立的实验室通过基因敲除实验发现,卵母细胞上的四次跨膜蛋白CD9是精卵融合的必需蛋白质[32～34]。CD9由4个跨膜结构域、2个胞外环以及3个短胞质片段组成[35]。精子上虽然也有CD9,但雄性小鼠精子在敲除cd9后仍可与正常卵子融合[36]。由此看出CD9对精卵融合的影响具有位置效应:只有卵母细胞上的CD9才是精卵融合必需的,精子上的CD9不参与此过程。卵母细胞上的CD9是介导精卵融合的必需蛋白质,但是基因敲除之后,仍然有极少数的雌性小鼠可以生育,这说明卵母细胞上可能还有其他的相关蛋白质,能够在一定程度上弥补CD9的功能缺失[22]。研究表明,含CD9的结构在成熟过程中从小鼠卵子中释放出来,通过调节精子黏附位点来促进精卵融合[37]。Ravaux等[38]研究发现,精子鞭毛摆动引起的振荡使CD9在卵黄膜聚集,为精卵融合提供条件;在精卵融合2～5 min后,大多数CD9离开卵子,推测这个过程与阻止多精入卵机制有关。

CD9与IZUMO1-JUNO复合物系统一样,在精卵融合的黏附过程中发挥作用。敲除cd9的卵子表面有更多精子黏附,但最强烈的作用模式却消失了,精子在卵周间隙积聚[39～41]。这说明CD9在黏附中的作用是给精卵之间提供足够的黏附力,从而使精卵质膜足够拉近,为下一步的融合提供条件。2014年Chalbi等[22]发现,IZUMO1识别JUNO后,CD9在JUNO驱动下开始在融合区域积累;但是在CD9缺失的情况下,精子仍黏附在卵母细胞上,表明CD9对于IZUMO1-JUNO复合物的形成不是必需的。此外,在CD9表型正常的卵母细胞上,CD9与JUNO顺式结合(直接或间接),形成具有较慢动力学的蛋白质复合物的一部分,在没有CD9时,IZUMO1的富集加速[22]。

4 结论与展望

现代社会中,不孕不育率逐年上升。受精机制的揭示,不仅可以对人类不孕不育疾病的治疗、避孕方法的改善等提供帮助,而且也可能会对家畜的繁育提供帮助。本研究小组始终认为,精卵细胞的最终融合需要精子上的多个蛋白质组成的复合体与卵细胞膜表面多个蛋白质组成的复合体共同发挥作用。正如本文所论述的,IZUMO1、JUNO和CD9是介导精卵融合的必需蛋白质。IZUMO1是精子上特异性表达的蛋白质,而JUNO是IZUMO1在卵细胞上的受体。CD9在IZUMO1-JUNO复合体的驱动下开始在二者接触的区域积累并为精卵融合提供足够的黏附力,而细胞融合也正好发生在这个位置。它们之间并不是独立存在的,而是有关联地共同介导完成细胞融合的过程,且它们都在精卵融合的黏附阶段就开始发挥作用。虽然目前已经鉴定出这3个精卵融合所必需的蛋白质,但我们对精卵融合的分子机制仍然所知甚少。

2013年Lorenzetti等[42]在构建转基因小鼠时,“意外”发现外来基因的插入导致小鼠17号染色体的部分缺失。该缺失导致了spaca6(sperm acrosome membrane-associated 6)基因表达的失活,而且其精子呈现出与izumo1基因缺失相类似的特点,即可以完成顶体反应并穿越透明带,但由于无法与卵细胞膜融合从而集聚在卵周空间内。SPACA6与IZUMO1具有非常相似的结构特征,都属于免疫球蛋白超家族的成员,Inoue等[28]推测其在精卵融合后期发挥作用。实际上,染色体的缺失会同时带来大量核苷酸片段的缺失,这些大量片段的缺失有可能会对受精造成潜在影响,但是现在仍缺乏进一步的实验证据证明染色体的完整性为精卵融合所必需。2016年Krauchunas等[43]提出“受精突触”的概念:精子与卵子间的相互作用,与T细胞和抗原呈递细胞参与的免疫应答调节——免疫突触在多方面具有相似性,这个框架或许对于我们了解受精的分子机制会有所帮助[44]。

本实验室前期采用酵母双杂交的方法分别利用IZUMO1和JUNO对大鼠卵巢cDNA文库进行了筛选,发现了大量可能参与精卵融合的潜在蛋白质,但是验证这些蛋白质是否真为体内受精过程的“关键因子”,还需要投入大量的工作。从2000年几乎3个实验室同时发现了CD9,到2005年IZUMO1被证实是受精必不可少的因子,再到2014年JUNO被发现是IZUMO1的受体,我们可以发现精卵融合相关蛋白质的探索仍会是一个“漫长”的过程。当然,新的研究手段的介入有望缩短这个进程。比如:生物信息学的应用可以减少多余实验,使得基因可以被批量的分析。这在一定程度上加快了基因筛选的进程。同时,CRISPR/Cas9基因编辑技术拓宽了受精研究的途径。定向诱变将CRISPR/Cas9以及模板DNA导入受精卵成像,可以观察所研究的因子如何在受精过程中发挥作用[45]。基因筛选和基因组编辑技术的综合应用,将为我们受精机制的研究提供新思路。总之,随着对受精相关基因深入的研究以及对蛋白质结构的进一步剖析,受精作用分子之谜的答案将会被逐一揭开。