杨 亮,张春林,吴德光,彭 涛,何 惠

(茅台学院酿酒工程系,贵州仁怀 564501)

中国白酒是世界六大蒸馏酒之一,2017年产量高达1198.1万千升,居世界首位[1]。中国白酒发展至今,已在酱、浓、清、米四大香型基础上衍生成13种香型[2],其中占据白酒行业利润榜首的酱香型白酒,在2017年以不足全国白酒5%产量,收获了白酒行业约35%的利润,高达450亿左右。酱香型白酒现已成为中国白酒中高利润、高产值的代表性产品,酱酒产量和产值的逐步提高,将为酒业发展增加极大助力。

酱香型白酒的稳健发展,与其品质的坚守及独特的风格密不可分。酱香型白酒风味物质的种类和含量均高于其他香型白酒[3],现阶段有较多对酱香型白酒风味物质的研究,采用了不同的技术手段对酱酒风味进行解析,如采用全二维气相色谱-飞行时间质谱联用技术(comprehensive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry,GC×GC/TOFMS)从酱香型茅台酒中定性出528种风味物质[4];采用气相色谱闻香法(gas chromatography-olfactometry,GC-O)及气相色谱质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)联用法从茅台酒中定性出79种香气成分[5];采用气相色谱-火焰离子检测器(gas chromatography-flame ionization detector,GC-FID)定量酱香型习酒中99种挥发性物质[6];采用GC-O和香味提取物稀释分析(aroma extract dilution analysis,AEDA)从酱香型白酒中鉴定出了143种风味物质,并对其香气的相对效能做了分析[7]。

酱香型白酒中约2%的风味物质赋予酒体独特风格,然而一些异嗅物质的存在,却给白酒的风味带来了负面的影响,降低了优质酱香型白酒的产量,造成了一定经济损失,阻碍着酱香型白酒产业的发展。对酱香型白酒缺陷酒的进一步研究,定性、定量异嗅化合物,避免异嗅物质的产生或去除异嗅物质的影响已成为一个重大问题[8]。

本文从酱香型白酒典型的缺陷风味着手,梳理了异嗅物质的分析检测方法、异嗅物质相关代谢菌、生物防控及酒体风味优化等几个层面的研究现状,并就现阶段研究的不足提出了建议、对未来研究前景做了展望。

1 酱香型白酒缺陷酒

白酒中的缺陷酒是指酒体不协调、偏离原香型应有的香、味、风格的基酒。在酿造过程中,因发酵条件控制不当、工艺操作及管理不善、各种生产用具及生产场所不洁都可能会导致缺陷酒的产生。白酒缺陷过重会制约勾调工作,影响成品酒的质量,从而影响白酒企业的经济效益[9]。

缺陷酒在酒精饮品基酒生产中普遍存在,不同酱香型白酒生产厂家对缺陷型的归类稍有区别,但被广泛认可的有泥臭味、盐菜味、异味、泥味、馊味、泥霉味、霉味、煤油味等8种,其中异味是除其他几种缺陷酒外暂未明确归类描述的缺陷型。酱香型白酒的几种典型缺陷酒中,以泥臭味、盐菜味和泥味占比较高,超过缺陷酒总量70%;馊味、泥霉味、霉味、煤油四类产量较少,总产量不超过缺陷酒3%。由此可见,提高酱香型优质白酒产量的重点在于控制泥臭味、盐菜味和泥味三类缺陷酒。酱香型白酒缺陷型的描述虽然在酱香型酒企中得到广泛使用,但不具有普适性,并不能应用于其它香型白酒,且个别缺陷型描述具有极强的独特性和地域性,如盐菜味等,无专业品评背景的研究人员较难识别、区分这8种缺陷型,这就给有效选取缺陷酒进行深入分析造成了困难。

2 酱香型白酒中的异嗅物质

除酒体风味物质不协调外,异嗅物质的存在是导致缺陷酒形成的重要因素。现阶段未见有系统研究酱香型缺陷酒及其异嗅物质的报道,且针对性的研究酱香型白酒中异嗅物质的文章较少,多以研究普遍存在于多种香型白酒中的异嗅物质为主,如硫化物类异嗅物质：糠硫醇(Furfuryl mercaptan,CAS:98-02-2)、甲硫醇(CH4S,CAS:74-93-1),脂肪族类异嗅物质:3-辛醇(3-OCTANOL,CAS:20296-29-1)1-辛烯-3-醇(1-OCTEN-3-OL,CAS:3191-86-4)等[10-11]。

科研领域所使用酱香型缺陷酒的风格描述多与酱香型白酒生产厂家描述的典型缺陷酒的气味略有区别。乔敏莎等[12]确认了酱香型白酒中臭味缺陷酒的异嗅物质为二甲基二硫(Dimethyl disulfide,CAS:624-92-0)和二甲基三硫(Dimethyl trisulfide,CAS:3658-80-8);杜海等[13-14]研究了普遍存在于多种香型白酒中,同样会导致酱香型白酒产生土霉味和蘑菇/真菌气味缺陷的异嗅物质,并建立了快速测定该异嗅物质的定量方法,分析了该物质在白酒生产过程中的变化规律,其中土霉味是由异嗅物质-土味素(Geosmin,trans-1,10-dimethyl-trans-9-decalol)引起的,蘑菇/真菌味是由3-辛醇和1-辛烯-3-醇。Ding等[15]鉴定了导致多种白酒(含酱香型白酒)中呈现出动物臭/皮毛臭的异嗅物质4-甲基苯酚(p-cresol,CAS:106-44-5);Zhao等[15]鉴定出酱香型白酒的焦臭味异嗅来源是2-羟甲基-3,6-二乙基-5-甲基吡嗪(2-Hydroxymethyl-3,6-diethyl-5-methylpyrazine)。

此外,在一些酱香型白酒风味物质研究中,间接发现了较多使酒体呈现异味缺陷型的异嗅物质。如Wang等[17]在研究酱香型白酒中萜烯类物质(Terpenes)时,发现酒中的冰片(borneol,CAS:507-70-0)具有樟脑(camphor)气味;汪玲玲[18]在研究酱香型白酒微量成分时发现3-甲基丁酸(Isovaleric acid,CAS:503-74-2)具有脂肪臭、丁子香酚(Eugenol,CAS:97-53-0)具有动物臭、二甲基二硫和二甲基三硫具有烂白菜味道;Chen等[19]在研究酱香型白酒挥发性硫化物的时候发现甲硫醇(Methanethiol,CAS:74-93-1)、乙硫醇(Ethanethiol,CAS:75-08-1)等具有烂卷心菜、焦橡胶等异味。

从上述整理分析后不难发现,科研领域研究的酱香型缺陷酒风格与酱香型生产厂家描述的几种典型缺陷并不一致,且研究样本并未完全覆盖酱香型所有类型缺陷酒,其他类型缺陷酒相关研究有待开展。

3 异嗅物质检测方法

异嗅物质作为白酒挥发性组分,与白酒风味物质的研究方法相似,主要包括香气物质提取与分离、异嗅化合物发现、异嗅化合物确认、异嗅物质定量4个部分[8,20]。

3.1 异嗅物质的定性方法

异嗅物质的提取多用液液萃取(liquid-liquid extraction,LLE)和顶空固相微萃取(head-space solid-phase microextraction,HS-SPME)两类方法,其中HS-SPME方法具有绿色、快捷的优点,可用DVB/CAR/PDMS、PDMS、CAR/PDMS、PDMS/DVB等不同类型萃取头进行萃取[17,21-22],但萃取结果容易受到萃取头极性和异嗅化合物挥发性的影响;LLE方法操作相对复杂,多用戊烷、乙醚、二氯甲烷等试剂萃取白酒中的香味物质,萃取后的有机相经分馏成水溶性、酸性和碱性三种组分[23-24],但耗时过长,在浓缩过程中易导致高挥发性风味物质损失。萃取组分经气相色谱-嗅闻(gas chromatography-olfactometry,GC-O)、Osme等[25-26]技术,识别出酒体中异嗅物质,再结合气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrography,GC-MS)[27]、气相色谱-氢火焰离子化检测器(gas chromatography-flame ionization detector,GC-FID)或气相色谱-脉冲式火焰光度检测器(gas chromatography-pulsed flame photometric detector,GC-PFPD)法[11,28],即可初步定性异嗅化合物,最后通过标准品添加实验,如二者香气特征、色谱保留时间及质谱信息完全一致,即可确认异嗅化合物[29]。

3.2 异嗅物质的定量方法

为表征异嗅物质的香味强度,常用阈值作为指标,并在此基础上,测定异嗅物质的气味活力值(odor activity value,OAV)以衡量异嗅物质在原酒体中的香气强度[30-31]。

对于异嗅物质在酒中含量的定量方法,面积百分比定量法(AERA)、峰高百分比法(HEIGHT)、归一化法(NORM)、外标定量法(ESTD)和内标定量法(ISTD)等是目前采用最多的几种定量方法[8]。

4 酱香型白酒中异嗅物质的代谢微生物

白酒中发酵过程中的微生物对白酒的风味有重要的影响,如地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)可代谢吡嗪、挥发酸、酚类等化合物[32],通过这些化合物影响酒体风味的呈现。

微生物不仅能代谢产生有益于白酒风味的化合物,也会代谢产生异嗅物质,影响白酒质量。普遍存在于多种香型白酒(含酱香)中的土霉味缺陷酒的本质是由萜烯类化合物土味素引起的,Du等[33]发现褶皱裸胞壳(Emericellarugulosa)和深绿色木霉(Trichodermaatroviride)具有产土味素的能力,并检测了清香型白酒发酵各环节中土味素的产生规律,在清香型大曲中鉴定出链霉菌(Streptomycesspp.)为土味素的关键代谢菌[34],在此基础上采用分子生物学手段钓取了土味素合成酶的编码基因(geoA),依据此保守序列建立了实时荧光定量PCR方法,实现了与土霉异味直接相关的微生物的定量分析[13]。随后，房海珍等[35]在传统凤型大曲中也分离培养出三株产土味素的白色链霉菌(Streptomycesalbus)。

在对白酒发酵过程中具有洋葱和煮熟蔬菜异嗅的硫化物3-(甲硫基)-1-丙醇(3-(Methylthio)-1-propanol,CAS:505-10-2)和二甲基二硫的研究过程中,Liu等[36]发现酵母菌(Saccharomycesspp.)和乳酸菌(Lactobacillusspp.)为其代谢核心微生物群,二类微生物的基因编码了31种参与硫化物代谢的酶,并发现其转录丰度在白酒发酵过程中具有协同效应。

对白酒中异嗅物质的代谢微生物研究非常少,针对酱香型白酒的研究更是凤毛麟角。鉴于酱香型白酒的发展现状及良好的发展趋势,针对酱香型白酒异嗅物质代谢菌的系统及深入研究亟待开展。

5 缺陷酒的生物防控

为降低缺陷酒产量,可从工艺层面及微生物层面着手。工艺层面的防治措施,对不同的缺陷型采用不同的方式,如控制原辅料蛋白含量降低白酒臭味物质产生、加强滴窖降低白酒酸味、控制原辅料比例以降低白酒糠味、控制上甑蒸馏气压以控制白酒苦味物质产生等[37-39]。

5.1 提高有益土著微生物含量

从微生物层面控制缺陷酒产量的相关研究较为前沿。在筛查出4-甲基苯酚的产生菌是梭状芽孢杆菌(Clostridiumspp.)基础上,通过提高酒醅中乳酸菌的含量以抑制梭状芽孢杆菌生长,从而降低产生动物气味的4-甲基苯酚的产量[40];在从酱香型白酒大曲及其他香型白酒大曲中筛选出土著芽孢杆菌(Bacillusspp.),发现其可抑制具有土霉味的土味素的链霉菌的生长代谢,因此通过增加芽孢杆菌生物量的方法,降低白酒中异嗅物质土味素含量,从而减少缺陷酒产量[41];地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)在固态发酵中代谢的地衣素可显著降低具有异嗅的酚类物质的挥发性,如分别表现出马厩味和药味的4-甲基苯酚和4-乙基愈创木酚(4-Ethyl-2-methoxyphenol,CAS:2785-89-9),故采用增加地衣芽胞杆菌含量或促进其代谢地衣素的方法以降低异嗅物质的挥发性,改善白酒风味[42]。

5.2 内源微生物改造及外源微生物添加

除了内源生物防控降低缺陷酒产量外,还可通过添加外源微生物或通过分子手段改造土著代谢菌的方法提高或降低某类物质含量,优化酒体,提高酒质。如添加地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)以促进酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)在酱香型白酒发酵过程中的风味代谢物产量[43];在发酵原料中添加葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum),使得大多数挥发性物质含量均有所增加,改善酒体品质[44];通过过表达酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的ATF1基因、敲除IAH1和BAT2基因,以降低酿酒酵母代谢乙酸酯类和高级醇类物质[45];枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)与白酒中棕榈酸(Hexadecanoic acid,CAS:57-10-3)、2-花生酰基甘油(2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)ethyl ester,CAS:53847-30-6)、乙偶姻(3-Hydroxy-2-butanone,CAS:513-86-0)等风味物质潜在或直接相关[46],通过过表达枯草芽孢杆菌乙偶姻还原酶基因bdhA和葡萄糖摄取蛋白基因glcU,增加枯草芽孢杆菌代谢乙偶姻及其衍生物川芎嗪(C8H12N2,CAS:1124-11-4)的代谢量[47],以改善白酒风味和提高白酒质量。

5.3 毒性物质防控

白酒生物防控并不只停留在异嗅研究层面,如采用微生物方法控制白酒中2A级致癌物氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)前体物尿素的生物合成,已成为控制EC生成的常见方法[48],研究者在酱香型白酒发酵过程中识别出可代谢EC的前体物质的代谢菌,并发现乳酸菌(Lactobacillusspp.)和非常规酵母可控制EC前体物的含量[49],并从大曲中筛选出可代谢脲酶的腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus),通过增加其生物量的方法以降解致癌物氨基甲酸乙酯的生成[50]。

6 酒体风味优化

6.1 去除异嗅物质

对于具有轻微异杂味的白酒,可用作调味酒来勾调白酒,然而具有严重异嗅味的基酒不能用于勾兑,否则会严重影响优质白酒质量,需采用后修饰技术将异嗅去除，方可用于成品酒勾兑。异嗅物质的去除方法主要有吸附法、氧化法、二次蒸馏法等三大类方法。吸附法所有介质种类较多,有树脂、硅藻土、活性炭、凹凸棒等,其中树脂在吸附效果及对白酒主体风味影响程度上优于其他几种吸附剂[51-53];氧化法去异嗅效果较好,如高锰酸钾氧化法,但处理后的酒体协调性将变差,若将高锰酸钾与活性炭等吸附剂联合使用,不仅可以有效去除异嗅物质,而且对酒体主体风味影响较少[54];二次蒸馏法有壶式蒸馏、常压蒸馏和减压蒸馏,基酒经二次蒸馏不仅可以保持酒体的主体风格,还可以有效去除基酒中4-甲基苯酚等异嗅物质[55],有利于酒体风味表现。

6.2 改善香气结构

白酒的风味不仅取决于酒体中的挥发性物质,非挥发性物质同样对白酒风味有重要作用。在风味层面,非挥发性物质主要通过与挥发性物质相互作用,影响挥发性物质的挥发性能,调节其香气持久性和放香强度,从而协调和改变白酒的风味结构。

酱香型白酒相对于其他香型白酒含有较多的非挥发性有机酸,如乳酸、十六酸、2-羟基-4-甲基戊酸等[56],此外,由地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)代谢产生的地衣素(Lichenysin),随着其含量的增加,可选择性的影响酒中挥发性物质,如通过氢键作用显著降低酱香型白酒中苯酚(酚味)、对甲基苯酚(动物臭、皮毛臭)4-乙基愈创木酚(药味)等异嗅酚类物质,可改善白酒香气品质[57]。

7 展望

酱香型白酒生产企业已将本香型8种典型的缺陷型做了描述性划分,并广泛应用于酱香型白酒生产过程中,指导成品酒的勾调与质量控制。但现阶段对酱香型缺陷酒的相关研究缺乏针对性和系统性,一方面是由于酒企对缺陷酒的典型性描述极具地域性,无相关背景的科研人员对其香气风格难以把握,从而对后续研究造成障碍;另一方面,在酱香型白酒生产过程中,缺陷酒的形成具有偶然性和随机性,这就在客观层面给异嗅物质的微生物溯源及代谢组学相关研究带来了困难。

虽然酒企会通过工艺改进降低缺陷酒产量,或采用技术手段改善成品酒香气,但现阶段还没有有效方法从根源控制多种异嗅物质的代谢。科研领域对白酒风味物质筛查、酿造微生物的基因组及转录组等技术已较为成熟,将这些技术嫁接到酱香型缺陷酒的相关研究中、建立科研院所与酒企的有效合作机制等,或是推动酱香型缺陷酒研究的着力点。