汤玲玲,倪振华,陈清阁,孟子誉,王雄彪

(上海中医药大学附属普陀医院，上海200062)

生理状态下黏蛋白(MUC)有助于转移并排出微生物和微粒，然而其异常表达和积累与肺癌密切相关[1]。MUC通过与各种分子相互作用，参与癌症进展和转移过程[2, 3]。其中，MUC5AC是一种分泌型高分子黏液素，其过量产生与肺癌进展相关，同样也是肿瘤增殖、耐药的重要标志[4,5]。姜黄素是从中药姜黄、莪术、郁金等的根茎中提取的一种天然有效成分[6]，可以有效抑制气道黏液分泌[7]。本课题组前期研究发现，姜黄素可以通过调控叉头框蛋白A2(FOXA2)抑制人肺鳞癌NCI-H292细胞增殖[8]。但姜黄素调控FOXA2在肺鳞癌发生中的精确生物学作用和作用机制尚不清楚。最新研究发现，姜黄素可以调控FOXA2抑制气道黏液分泌[9],且FOXA2表达依赖信号转导及转录激活蛋白6(STAT6)信号通路的调控[10]。2017年1月～2018年4月，我们观察了姜黄素对NCI-H292细胞MUC5AC表达的调控作用，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞 NCI-H292细胞购自于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，已通过支原体检测以及STR检测。

1.1.2 试剂 姜黄素(S184801)，购于Selleck生物科技有限公司；胎牛血清(41F9144K)、RPMI1640培养液(8117079)、Opti-MEM培养基(1749786)，购于美国赛默飞世尔科技公司；DMSO(RNBD6084)，购于美国Sigma公司；FOXA2抗体(ab108422)，购买于英国Abcam公司；MUC5AC抗体(sc-21701)，购于美国Santa Cruz公司；p-STAT6抗体(9361)，购于美国Cell Signaling公司；蛋白裂解液(106M4000V)，购于美国Sigma公司；蛋白酶抑制剂(410035)、磷酸酶抑制剂(510024)，购于瑞士Biotool公司；BCA蛋白定量试剂盒(P0010)，购于上海碧云天生物有限公司；ECL发光显色液(170-5060)，购于美国Bio-Rad公司；FOXA2 siRNA(717850)，购于上海吉玛制药技术有限公司；TransIT-TKO®转染试剂(61053424)，购于美国Mirusbio公司；NE-PER细胞核提取试剂盒(QA210136A)，购于美国赛默飞世尔科技公司。STAT6抑制剂Keampferol(s2314)，购于美国Selleck生物科技有限公司。

1.1.3 仪器 超声波振动仪(VCX-130)，购于美国SONICS公司；蛋白电泳仪(Mini-PROTEAN Tetra)，购于美国Bio-Rad公司；多功能微孔板读数仪(VL0000D0)，购于美国ThermoFisher公司；凝胶成像分析仪(JS-1050)，购于上海培清科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 NCI-H292细胞培养 NCI-H292细胞采用含10%胎牛血清、100 mg/L青霉素、100 mg /L链霉素的RPMI1640培养液培养，置于37 ℃、5% CO2培养箱培养，待细胞融合达80%～90%时传代用于后续实验。

1.2.2 姜黄素对NCI-H292细胞MUC5AC、FOXA2表达影响观察 取对数生长期细胞，以5×105/孔接种6孔板。将细胞分为两组，姜黄素组加入终浓度40 μmol/L的姜黄素，对照组加入等量DMSO；分别于处理1、3、24、48 h，采用Western blotting法检测细胞中的MUC5AC、FOXA2。具体步骤：加入裂解液与蛋白酶抑制剂裂解细胞提取总蛋白，采用BCA蛋白定量调节各组蛋白浓度。配置10%凝胶电泳并使用PVDF膜湿转，5% BSA封闭2 h；加入MUC5AC、FOXA2和β-actin抗体，4 ℃孵育过夜。第2天TBST洗3次，每次10 min；加入羊抗兔IgG或鼠抗兔IgG二抗，室温孵育2 h；再用TBST洗3次，每次10 min；最后用ECL发光液显色，采用Image J软件进行灰度值分析。以目的蛋白与β-actin灰度比值表示各目的蛋白的相对表达量。

1.2.3 姜黄素对FOXA2降表达NCI-H292细胞MUC5AC表达影响观察 取对数生长期细胞，以3×105/孔接种6孔板。将细胞分为两组，FOXA2 siRNA组和NC-siRNA组采用TransIT-TKO®转染试剂分别给予FOXA2 siRNA、negative-siRNA 3.4 μL转染24 h；采用Western blotting法检测MUC5AC、FOXA2，方法同1.2.2。将转染后的两组细胞分别予以姜黄素40 μmol/L、等量DMSO孵育48 h，采用Western blotting法检测MUC5AC，方法同1.2.2。

1.2.4 姜黄素抑制STAT6磷酸化入核调控FOXA2基因表达影响观察 取对数生长期细胞，以5×105/孔接种6孔板。将细胞分为两组，姜黄素组加入终浓度40 μmol/L的姜黄素，对照组加入等量DMSO；分别于处理1、2、3、4、5 h，采用Western blotting法检测细胞中的p-STAT6，方法同1.2.2。将细胞分为对照组、抑制剂组、姜黄素组，分别予以DMSO、Kaempferol 10 μmol/L及姜黄素40 μmol/L处理48 h，采用RT-PCR法检测FOXA2 mRNA。具体步骤：每孔加入750 μL TRIzol后采用相应试剂盒进行RNA的提取与逆转录，操作方法严格按照试剂盒说明书进行，取逆转录产物进行RT-PCR。反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共 45个循环。引物序列：FOXA2上游5′-GGAGCAGCTAC-TATGCAGAGC-3′，下游5′-CGTGTTCATGCCGTTCA-TCC-3′；β-actin上游5′-CCAACCGCGAGAAG-ATGA-3′，下游5′-CCAGAGGCGTACAGGGATAG-3′。以2-ΔΔCt法计算FOXA2 mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 姜黄素对NCI-H292细胞MUC5AC、FOXA2表达的影响 与对照组比较，姜黄素组随作用时间延长MUC5AC表达逐渐降低而FOXA2表达逐渐增高(P均<0.01)。见表1。

表1 姜黄素对NCI-H292细胞MUC5AC、FOXA2表达的影响

注：与对照组比较，*P<0.01。

2.2 姜黄素对FOXA2降表达NCI-H292细胞MUC5AC表达的影响 与NC-siRNA组比较，FOXA2 siRNA组FOXA2表达水平降低而MUC5AC表达均增高(P均<0.01)。见表2。与同组DMSO作用细胞比较，NC-siRNA组、FOXA2 siRNA组加入姜黄素后MUC5AC表达均降低(P均<0.01)。见表3。

表2 FOXA2降表达对NCI-H292细胞MUC5AC表达的影响

注：与NC-siRNA组比较，*P<0.01。

表3 姜黄素对FOXA2降表达NCI-H292细胞MUC5AC表达的影响

注：与同组DMSO作用细胞比较，*P<0.01。

2.3 姜黄素抑制STAT6磷酸化入核调控FOXA2基因表达 姜黄素组作用1、2、3、4、5 h时细胞中p-STAT6相对表达量分别为0.123±0.010、0.122±0.091、0.120±0.011、0.118±0.007，均低于对照组的0.210±0.021(P均<0.01)，各时点间比较差异无统计学意义(P均>0.05)。对照组、抑制剂组、姜黄素组FOXA2 mRNA相对表达量分别为1.314±0.323、8.123±2.084、41.154±18.384，对照组<抑制剂组<姜黄素组(P均<0.01)。

3 讨论

肺癌是全球癌症死亡的主要原因，85%的肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)[11]。目前已证实有13种MUC在人气道上皮表达，其中MUC5AC是气道黏液素中的主体蛋白，且MUC5AC的异常表达与NSCLC的诊断及预后密切相关[12]。研究发现，MUC5B、MUC5AC和MUC6在侵入性黏液腺癌中过度表达，尤其是杯状细胞中，且MUC5AC蛋白在K-RAS阳性肿瘤细胞中表达更高[13]。MUC5AC和MUC5B可作为潜在的标志物，有助于界定纤毛性腺癌，包括中央型腺癌和黏液腺癌，从而区别于终末呼吸单位(TRU)腺癌[14]。机制研究发现，NSCLC细胞株敲除MUC5AC后可以降低其与整合素β4相互作用，从而抑制黏附斑激酶(Y397)磷酸化，减少NSCLC细胞迁移[13]。MUC5AC在哮喘及慢性阻塞性肺病等呼吸系统疾病中研究深入，但其在肺鳞癌中的生物学作用及机制研究仍未明确。

FOXA2又名HNF3β，属于叉头转录因子超家族；FOXA2作为MUC5AC的转录抑制子，是调控MUC5AC表达的关键蛋白[15]。动物实验发现，敲除FOXA2基因后小鼠肺组织发育不良，死亡率增加，且增加FOXA2表达可显著降低哮喘小鼠黏液分泌[16,17]。目前，鲜有研究报道FOXA2的上游信号通路。部分研究表明，表皮生长因子受体信号通路的激活以及IL-13、IL-4等炎性因子的表达增加，可以诱导转录因子STAT6与STAT3激活，从而增加了MUC5AC的转录水平，同时下调MUC5AC负调控因子FOXA2表达，进一步促使MUC5AC表达[18,19]。同时，Choi等[10]进一步研究发现，转录因子STAT6磷酸化入核后可抑制FOXA2表达，从而增加MUC5AC基因转录。

姜黄素在肺癌治疗中的疗效显著，目前研究成果主要集中在姜黄素抑制肺癌细胞增殖、侵袭转移以及多药耐药等生物学表现，其分子机制也主要围绕姜黄素诱导细胞凋亡、细胞自噬、降低DNA甲基化等表观遗传学改变[20]。本课题组最新研究发现，姜黄素可以有效抑制肺鳞癌NCI-H292细胞增殖，且通过组织芯片发现肺鳞癌组织中FOXA2表达水平较正常癌旁组织明显降低，而敲除FOXA2后NCI-H292细胞增殖速度增加[8]。因此，我们推测姜黄素可以通过调控转录抑制因子FOXA2抑制NCI-H292细胞增殖，但其作用靶蛋白及生理与病理意义仍未明确。

本研究发现，姜黄素作用NCI-H292细胞1～48 h的FOXA2蛋白表达水平增加，同时MUC5AC蛋白表达降低，且干扰FOXA2表达后姜黄素抑制MUC5AC表达作用增强。因此我们认为，姜黄素通过增加FOXA2表达从而抑制NCI-H292细胞MUC5AC分泌。为进一步探究FOXA2的上游基因，我们通过提取NCI-H292细胞核蛋白发现姜黄素作用1～5 h均可有效增加转录因子STAT6磷酸化入核，且STAT6抑制剂作用后FOXA2基因表达水平增高。此外，研究中我们发现，姜黄素较STAT6抑制剂对FOXA2基因的上调作用更强，因此STAT6可能不是姜黄素上调FOXA2表达的惟一上游基因。基于以上研究结果，我们认为姜黄素通过抑制STAT6磷酸化入核增加FOXA2表达，从而抑制NCI-H292细胞表达MUC5AC。